为探究干扰叉头转录因子O1(Forkhead box protein O1, FOXO1)对牛前体脂肪细胞增殖和分化的作用，本研究以固原黄牛的前体脂肪细胞为研究对象，采用组织块法分离牛前体脂肪细胞，并利用表型鉴定和标志基因表达谱2种方法鉴定所分离细胞的纯度和分化潜能。筛选并包装牛FOXO1干扰慢病毒，利用EdU染色、流式细胞术、油红O染色和qPCR方法探究干扰FOXO1对牛脂肪细胞增殖和分化的作用。结果表明：1）成功分离了牛前体脂肪细胞，且其具有较高的纯度和分化潜能。2)EdU染色结果表示，侵染Lv-FOXO1极显著增加了牛脂肪细胞的增殖率（P<0.01）。3）流式周期结果显示，干扰FOXO1显著增加了牛脂肪细胞S期阳性细胞的比例，促进了G1/S期的转化，进而促进了牛脂肪细胞增殖。4）干扰FOXO1后，增殖标志基因PCNA、CDK1和CDK2的表达量均极显著上调（P<0.01）。5）干扰FOXO1后牛前体脂肪细胞脂滴生成明显减少，且成脂标志基因PPARG的表达极显著下调（P<0.01）,CEBPB和LPL的表达显著下调（P<0.05）。综上，干扰FOXO1可通过上调增殖标志基因PCNA、CDK1和CDK2的表达促进牛脂肪细胞G1/S期的转化，进而促进牛脂肪细胞增殖，且其可通过降低成脂标志基因PPARG、CEBPB和LPL的表达减少牛脂肪细胞脂滴形成，进而影响脂肪沉积。本研究可为中国地方黄牛的肉质遗传改良提供理论依据。

【目的】骨骼肌是动物机体的重要组成成分，其生长发育直接影响畜禽肉产量，叉头转录因子O1(forkhead box protein O1, FoxO1)作为重要的转录调控因子，其与骨骼肌生长发育密切相关。探究过表达FoxO1对牛骨骼肌细胞增殖、凋亡与分化的作用，为肉牛遗传改良提供基础材料。【方法】采集牛的多个组织样品，提取其RNA并反转录，利用实时荧光定量PCR(qPCR)构建FoxO1组织表达谱。利用酶消化法分离得到牛骨骼肌细胞，通过观察其分化后肌管的形成以及qPCR检测其分化标志基因的表达情况来检验所分离细胞的分化性能。利用免疫荧光技术对牛骨骼肌细胞进行FoxO1亚细胞定位。设计并包装牛FoxO1过表达腺病毒，以提高牛骨骼肌细胞内FoxO1的表达。利用EdU染色检测过表达FoxO1对细胞相对增殖率的影响。利用流式细胞术检测过表达FoxO1对细胞周期分布的影响。利用qPCR检测过表达FoxO1对牛骨骼肌细胞增殖、凋亡和分化相关基因表达水平的影响。【结果】组织表达谱结果显示FoxO1在多个组织中均有表达，其在成年牛的背脂中表达量最高，在背最长肌组织中表达量最低，且FoxO1在犊牛背最长肌组织中的表达量要极显著高于成年牛的（P<0.01）。亚细胞定位结果显示FoxO1在牛骨骼肌细胞的细胞核和细胞质内均有表达，其细胞核内荧光强度高于细胞质。成功构建FoxO1过表达载体，并完成FoxO1重组过表达腺病毒的包装与扩繁，在感染牛骨骼肌细胞后，能显著提高FoxO1表达水平（P<0.01）。EdU检测显示过表达FoxO1会显著降低细胞增殖率（P<0.01），流式细胞周期检测显示过表达FoxO1会显著增加G1期细胞数并减少S期和G2期细胞数，抑制细胞G1/S期的转化，并减少G2期细胞的形成。利用qPCR进一步检测发现，增殖相关基因PCNA、CDK1、CDK2、CCNA2、CCNB1、CCND1和CCNE2均极显著下调（P<0.01），促凋亡相关基因BAD和BAX显著上调以及抑凋亡基因BCL2显著下调（P<0.05）。过表达FoxO1导致牛骨骼肌细胞肌管形成量减少，qPCR检测结果发现，骨骼肌分化相关基因MYOD、MYOG、MYF5、MYF6和MYHC的表达量显著下调（P<0.05）。【结论】FoxO1在牛的不同组织中均有表达，是一个广泛存在的转录调控因子，并且在背最长肌组织生长发育不同阶段存在表达差异，起到阶段调控作用。FoxO1在细胞核和细胞质中均发挥重要的转录调控作用，特别是在细胞核内。过表达FoxO1可能通过抑制细胞增殖相关基因和肌细胞分化相关基因的表达，从而抑制牛骨骼肌细胞的增殖与分化，并且可能通过上调促凋亡基因的表达和下调抑凋亡基因的表达来促使牛骨骼肌细胞凋亡的发生。

为了探究lncRNA2099对猪前脂肪细胞增殖分化的影响，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测lncRNA2099在猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背肌和背脂及离体培养的前体脂肪细胞增殖和分化阶段的表达水平；利用核质分离技术确定lncRNA2099在脂肪细胞中的表达位置；构建真核表达载体pcDNA3.1-lncRNA2099,采用qRT-PCR技术检测在脂肪细胞内过表达该lncRNA后对脂肪细胞增殖、分化相关标志基因表达的影响。结果显示：lncRNA2099存在明显组织表达特异性，且在肾脏和背脂中高表达，在背肌中不表达；lncRNA2099在猪前脂肪细胞增殖阶段12 h表达量最高，随后逐渐降低。在分化阶段第2天表达量最高，随后逐渐降低。核质定位结果表明，lncRNA2099在细胞核与细胞质中均有表达；在脂肪细胞内过表达lncRNA2099后，增殖标志基因P21与成脂分化标志基因LPL表达量极显著升高。lncRNA2099可能作为转录调节因子抑制猪前脂肪细胞增殖、促进成脂分化。

【目的】探讨甘薯sporamin蛋白对3T3-L1前脂肪细胞分化与增殖的影响,为开发预防和治疗肥胖、糖尿病的保健食品提供理论依据。【方法】采用硫酸铵沉淀、离子交换、凝胶过滤层析的方法对‘55-2’甘薯中的sporamin蛋白进行分离纯化。然后,以黄连素为阳性对照,用不同浓度sporamin(0、0.025、0.125、0.250、0.500、1.000mg·ml-1)处理3T3-L1前脂肪细胞。采用油红O染色和比色定量检测细胞内脂肪生成及细胞分化程度,以MTT法检测细胞的增殖。【结果】经离子交换、凝胶层析可纯化出高纯度的sporamin蛋白A和B(相对分子量分别为31kD和22kD)。与空白相...

【目的】构建鸡HOPX基因(homeodomain only protein X)全长编码区(coding region sequence,CDS)的真核表达载体,转染鸡原代前脂肪细胞,探讨HOPX基因过表达对鸡原代前脂肪细胞增殖的影响。【方法】利用Primer Premier 5.0软件设计鸡HOPX基因CDS区上、下游引物,以AA肉鸡腹部脂肪组织的cDNA为模板,采用PCR扩增、克隆鸡HOPX基因全长CDS区,并将其亚克隆至真核表达载体(pCMV-HA vector),获得HOPX基因的真核表达载体pCMV-HA-HOPX。采用双酶切鉴定、测序及Western blotting方法分析鉴定...

【目的】肉牛肌内脂肪沉积与牛肉的风味、多汁性和嫩度密切相关。脂肪沉积过程表现为脂肪细胞的增殖（数量增多）和分化（脂质生成），受到了多基因协同调控。前人研究发现，小鼠中Snail1可以参与肌肉发育和脂质稳态调控，但其在牛脂肪生成过程中的作用仍未知，有待进一步研究。【方法】以秦川牛为研究对象，克隆得到Snail1 CDS区序列，构建Snail1时空表达谱，运用生物信息学软件对其功能结构及靶基因进行预测。进一步，通过RNAi干扰结合CCK8、EdU、细胞流式及实时荧光定量PCR等方法探究Snail1对牛脂肪细胞增殖的影响。【结果】秦川牛Snail1与NCBI公布序列相比存在2处碱基同义突变，其在秦川牛新生牛肺、肾周脂肪、小肠呈现较高丰度表达；而在成年牛中，Snail1在肾周脂肪组织中的表达量最高，背最长肌中的表达量次之，肺脏组织中的表达量最低。生物信息学分析发现，Snail1启动子区存在1个651 bp CpG岛及C/EBP、PPARα等与脂肪生成相关的转录因子结合位点。CKⅠ(Ser92/96)、CKⅡ（Ser25/119,Thr89）、CDK1(Ser13/104/112/119/143/183/214/221)、CDK5(Ser105/107）等多个细胞周期相关激酶可能参与了Snail1蛋白的磷酸化修饰。通过对牛已注释基因启动子区提取、靶基因预测及KEGG动态网络构建发现，成脂相关的MAPK、PI3K-Akt、mTOR等信号通路为Snail1参与脂肪生成相关的潜在节点信号通路。进一步，通过RNAi干扰试验对其功能研究表明，Snail1下调促进了牛前体脂肪细胞的增殖，增加了复制期阳性细胞的比例（P<0.01）且促进了G1/S细胞周期转换。RT-qPCR和Western-blot检测表明，干扰Snail1显著上调了促增殖调控基因CCNB1、CCND2、CDK2、CDK4(P<0.05)和蛋白的表达。【结论】Snail1在新生牛肾周脂肪及成年牛肾周脂肪和背最长肌中表达量相对较高。干扰Snail1促进了牛前体脂肪细胞的增殖、G1/S细胞周期转变和CCNB1、CCND2、CDK2、CDK4等增殖相关基因表达；CKⅠ、CKⅡ、CDK1/5等多个细胞周期相关激酶可能通过磷酸化修饰Snail1蛋白进而参与细胞增殖调控，而MAPK、PI3K-Akt、mTOR等为Snail1影响牛脂肪细胞增殖潜在的关键节点通路。研究结果为进一步探究Snail1参与牛脂肪生成作用机制奠定了基础。

在培养基中添加葡萄糖和甲状腺素(T3),观察鸡前脂肪细胞的生长及分化后的增殖情况及检测THRSPα基因在不同时间段的表达情况。结果表明,葡萄糖和甲状腺素(T3)的使用没有显著促进脂肪细胞数量的增长,各试验组在前3 d细胞数量保持一定幅度的增长,但低于对照组,第4天数量降幅很大,除200 nmol/L T3外其他3组在第5天稍有回升,组间差异不显著(P>0.05)。添加50 nmol/L T3和200 nmol/L T3的2个试验组THRSPα基因相对表达量在第2天有较大幅度的增加且差异极显著(P

【目的】建立牛前体脂肪细胞的体外分离培养方法,研究牛前体脂肪细胞的生物学特性和分化特征,为研究牛脂肪发育和脂肪沉积的机制提供一种简便有效的细胞模型。【方法】采用Ⅰ型胶原酶消化法自新生牛脂肪组织中获得前体脂肪细胞,对培养的牛前体脂肪细胞进行形态学观察、生长曲线测定、油红O染色及脂肪细胞标志基因LPL、PPAR-r和脂联素表达研究。【结果】80%的牛前体脂肪细胞接种后12h开始贴壁,4d后开始向脂肪细胞转化,10d后绝大部分细胞脂滴融合,细胞脂肪含量增加;分离的牛前体脂肪细胞接种后1~2d生长缓慢,3~8d进入对数生长期,9d后进入平台期,之后细胞数目开始下降。经胰岛素诱导分化过程中,LPL在牛前...

【目的】探究bta-miR-33b对牛前体脂肪细胞分化的作用,并对此过程中潜在的靶基因进行验证。【方法】分离培养秦川牛前体脂肪细胞并进行诱导分化,PCR检测bta-miR-33b在前体脂肪细胞分化过程中的时序表达。对牛前体脂肪细胞体外转染bta-miR-33b的mimic、mimic negative control (mimic NC)、inhibitor、inhibitor negative control (inhibitor NC)进行诱导分化培养,于分化培养的不同时间取样,检测脂肪细胞分化标志基因(过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因、CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)基因、脂肪酸结合蛋白4(FABP4)基因)的mRNA表达量及甘油三酯和脂滴含量。预测bta-miR-33b的靶基因,并通过双荧光素酶报告系统验证靶向关系、Western Blot检测靶蛋白的表达量。【结果】在秦川牛前体脂肪细胞分化过程中,bta-miR-33b的表达量呈下降趋势。在前体脂肪细胞分化过程中,bta-miR-33b mimic可抑制脂肪分化标志基因的表达,降低细胞中甘油三酯和脂滴的含量; bta-miR-33b inhibitor可促进脂肪分化标志基因的表达,提高甘油三酯和脂滴的含量。高迁移率族蛋白A2(High mobility group AT-hook 2,HMGA2)基因、扭曲相关蛋白(Twist family bHLH transcription factor 1,TWIST1)基因是bta-miR-33b的靶基因;脂肪细胞分化过程中,bta-miR-33b能够调控HMGA2和TWIST1蛋白水平的表达。【结论】bta-miR-33b对秦川牛前体脂肪细胞体外分化具有抑制作用;HMGA2和TWIST1是bta-miR-33b的靶基因。

［目的］本文旨在研究核受体共激活蛋白２（ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ ２，ｎｃｏａ２）对猪肌内前体脂肪细胞分化能力的影响。［方法］用荧光定量ｐｃｒ（ｑｒｔ－ｐｃｒ）法检测ｎｃｏａ２在猪肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达变化；通过ｎｃｏａ２小干扰ｒｎａ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｒｎａ，ｓｉｒｎａ）抑制内源ｎｃｏａ２的表达，并用油红ｏ染色检测沉默ｎｃｏａ２对肌内前体脂肪细胞分化能力的影响，通过ｑｒｔ－ｐｃｒ检测沉默ｎｃｏａ２对脂肪分化关键基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒγ，ｐ．．．

为鉴定牛叉头框转录因子1(Forkhead box,FoxO1)的核心启动子区及其关键转录因子，利用PCR扩增牛FoxO1基因的启动子序列，同时设计7个逐段缺失片段引物扩增其启动子逐段缺失片段，进一步将其构建双荧光素酶报告载体并分别转染小鼠C2C12和3T3-L1细胞系，通过检测不同缺失片段荧光素酶报告载体的活性，以确定牛FoxO1启动子的核心区域；使用Genomatix和JASPAR在线软件预测牛FoxO1基因启动子核心区域的关键转录因子，采用定点突变试验在小鼠C2C12细胞系中初步鉴定预测的关键转录因子对FoxO1的转录调控作用。结果表明：1）成功扩增了牛FoxO1的启动子区1 920bp序列，获得了FoxO1基因启动子序列的7个逐段缺失片段序列；2）经双荧光素酶报告试验进一步证实，牛FoxO1基因核心启动子位于-285/-27区域；3）预测并通过定点突变试验鉴定出MEF2A、KLF4、HOXA5和KLF5转录因子对FoxO1基因的转录活性具有关键调控作用。综上，本研究初步鉴定出牛FoxO1基因启动子核心区（-285/-27）内转录因子MEF2A、KLF4、HOXA5和KLF5对FoxO1基因有重要的转录调控作用，为FoxO1基因对牛肌肉脂肪发育过程中的转录调控机制奠定了一定理论基础。

【目的】探讨猪肌内脂肪细胞与皮下脂肪细胞的基因表达差异。【方法】通过改进的胶原酶消化法,分别从猪(大×长二元杂)皮下脂肪组织和背最长肌肌肉组织中分离脂肪前体细胞,用850nmol·L-1胰岛素和50nmol·L-1地塞米松诱导细胞分化,采用油红O提取法测定细胞分化过程中的聚酯水平。同时采用实时荧光定量PCR方法检测细胞分化过程中的转录调控因子基因(PPARγ、C/EBPβ与SREBP-1)、脂肪合成酶相关基因(GPDH、ACC和SCD-1)、脂肪酸转运相关基因(LPL、FAT与AP2)以及肌肉旁分泌因子受体基因(ACVR2B、IL-6R和IGF-1R)的表达模式。【结果】猪肌内脂肪前体细胞诱导...

为分析山羊KLF16对肌内前体脂肪细胞分化的调控作用,利用RT-PCR克隆得到山羊KLF16基因序列,利用生物信息学分析山羊KLF16基因序列特征,通过过表达、油红O染色和qPCR等方法从形态学及分子水平分析过表达山羊KLF16后肌内脂肪细胞脂滴积聚及分化标志基因表达水平的变化。结果表明:1)克隆得到包含CDS区的山羊KLF16基因序列986bp,编码251个氨基酸,具有典型锌指结构;2)KLF16在山羊各组织广泛表达,其中腹部皮下脂肪组织表达量极显著高于其他组织(P<0.01);3)过表达山羊KLF16与对照组相比脂肪细胞脂滴积聚减少,分化标志基因PPARγ和PPARα极显著下调(P

近几年来延黄牛因肉质优良、口味独特、有典型的大理石花纹等特点入选为我国五大良种牛之一,越来越多地受到消费者的青睐。为建立延黄牛前体脂肪细胞的体外培养体系,从细胞和分子水平探索延黄牛脂肪细胞的生物学特性及潜在的分化机制,采用胶原酶消化法对延黄牛皮下前体脂肪细胞进行分离,对其进行形态学观察并绘制生长曲线,油红O染色法检测成脂诱导分化过程中的脂质积累,利用甘油三酯酶法测定细胞内甘油三酯,采用实时荧光定量RT-PCR的方法检测脂肪细胞成脂标志基因过氧化物酶体增殖体激活受体γ(PPARγ)、CCAAT/增强子结合蛋

近几年来延黄牛因肉质优良、口味独特、有典型的大理石花纹等特点入选为我国五大良种牛之一,越来越多地受到消费者的青睐。为建立延黄牛前体脂肪细胞的体外培养体系,从细胞和分子水平探索延黄牛脂肪细胞的生物学特性及潜在的分化机制,采用胶原酶消化法对延黄牛皮下前体脂肪细胞进行分离,对其进行形态学观察并绘制生长曲线,油红O染色法检测成脂诱导分化过程中的脂质积累,利用甘油三酯酶法测定细胞内甘油三酯,采用实时荧光定量RT-PCR的方法检测脂肪细胞成脂标志基因过氧化物酶体增殖体激活受体γ(PPARγ)、CCAAT/增强子结合蛋