【目的】探讨表皮生长因子(EGF)对体外培养的绵羊附睾上皮细胞(EECs)增殖的影响。【方法】分离培养EECs,利用免疫荧光检测角蛋白18(CK18)对分离的细胞进行鉴定,用CCK-8法测定EGF的最佳作用质量浓度,用RT-PCR检测EECs中附睾分子标记——谷胱甘肽过氧化物酶-5(GPX5)和雄激素受体(AR)基因的表达情况,用流式细胞仪法检测EGF对EECs细胞周期和凋亡的影响。将P_4代EECs分别用表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂Gefitinib、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路抑制剂LY294002和DMSO(对照组)处理后,再用EGF培养,用流式细胞仪法检测细胞周期和凋亡情况。将P_4代EECs分别用EGF(-)、EGF、EGF+Gefitinib和EGF+LY294002处理后,用Western blot检测细胞中EGFR、AKT和叉头盒蛋白O1(FOXO1)磷酸化水平。【结果】分离培养的EECs可表达CK18,细胞纯度较好;EGF对EECs增殖促进效应呈浓度依赖性,用含50 ng/mL EGF培养基培养的EECs具有最高的增殖潜能,且不同传代EECs细胞均可正常表达GPX5和AR;EGF处理S期EECs细胞比例极显著升高(P<0.01),凋亡指数显著降低(P<0.05)。与对照组相比,Gefitinib组S期EECs细胞比例极显著降低(P<0.01),LY294002组S期细胞比例显著降低(P<0.05);Gefitinib组EECs细胞的凋亡指数极显著升高(P

为研究雄激素和氢化可的松对山羊附睾上皮细胞生长的作用模式,本研究利用酶标仪检测附睾头部上皮细胞增殖情况,实时荧光定量PCR及ELISA检测雄激素受体(AR)的表达,检测睾酮与氢化可的松对山羊附睾上皮细胞体外增殖的作用以及对AR表达的影响。结果表明:100nmol/L睾酮对附睾头上皮细胞增殖的促进效应最高且与对照组差异极显著(P<0.01)。本研究表明睾酮和氢化可的松对附睾头上皮细胞体外增殖均有促进作用,呈明显的浓度依赖性,且二者之间存在协同作用,这为进一步研究附睾上皮细胞增殖及功能的调节机理提供了基础。

通过体外试验研究胰岛素样生长因子1(IGF-1)对山羊瘤胃上皮细胞增殖的影响,胰岛素样生长因子1型受体(IGF-1R)以及受体后信号转导途径在此过程中所起的作用。试验采用IGF-1、IGF-1R抑制剂分别处理体外培养的瘤胃上皮细胞,研究IGF-1对瘤胃上皮细胞增殖、细胞周期蛋白表达及增殖相关信号转导途径中关键蛋白的活化水平;并用添加胞外调节蛋白激酶(ERK)抑制剂、蛋白激酶-B(AKT)抑制剂处理,研究增殖相关信号转导途径在IGF-1诱导瘤胃上皮细胞增殖中的作用。结果表明:IGF-1显著提高体外培养瘤胃上皮细胞3H-TdR掺入率(P<0.05...

　通过有效的细胞培养方法获得山羊乳腺上皮细胞系,对这些细胞形态进行光镜观察,结果发现,细胞可形成闭合型和开放型细胞群,闭合型细胞群边界清晰,细胞之间结合紧密;开放型细胞群边界不清,细胞相互分散存在于一局限的范围内。乳腺上皮细胞与成纤维细胞混生时分区生长,界线明显;细胞之间形成许多腔状结构。纯化的乳腺上皮细胞通过单细胞悬浮后传代,部分细胞形成岛屿状聚集,部分细胞以贴壁的自由单个细胞散在形式存在。上皮细胞增殖可形成圆顶型结构,呈乳头状(称之为乳球体);乳腺上皮细胞可产生并分泌乳汁,分泌到细胞外的乳汁流动形成网状结构。山羊乳腺上皮细胞含不同的细胞类型,大多数上皮细胞呈短梭形或多角形,细胞之间紧密相靠...

【背景】MicroRNAs(miRNA)是一类小RNA分子（18—23nt），广泛参与了家畜乳腺发育和泌乳性能的调控。项目组前期在小尾寒羊上应用RNA-Seq研究发现，miR-221在空怀期乳腺组织中的表达量是泌乳期的3.6倍，但是尚不清楚miR-221对绵羊乳腺发育的调控机制。【目的】探讨miR-221是否通过靶向基因IRS1抑制绵羊乳腺上皮细胞的活力和增殖数量，为揭示miR-221对绵羊泌乳性能的分子调控机理提供理论参考。【方法】采集小尾寒羊乳腺、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、背最长肌和卵巢等8个组织样本，采用实时荧光定量PCR(reverse transcription-quantitative PCR,RT-qPCR)技术，构建miR-221在绵羊8个组织中的表达谱。采用细胞转染、CCK-8和Edu等方法，研究miR-221对绵羊乳腺上皮细胞活力和增殖的影响。利用miRDB和miRanda数据库，预测miR-221的靶基因，结合功能富集分析，确定目标靶基因，构建靶基因的野生型和突变型载体，进而用双荧光素酶报告实验，验证miR-221与预测靶基因间的靶向关系。分析过表达和沉默miR-221对靶基因及其信号通路下游功能基因的影响。【结果】RT-qPCR结果表明，miR-221在绵羊乳腺等8个组织中均表达，其中在肺脏和脾脏中的表达量最高，在背最长肌和肾脏中的表达量最低。CCK-8结果表明，miR-221模拟物抑制了绵羊乳腺上皮细胞的活力（P<0.01），而miR-221抑制剂提高了乳腺上皮细胞的活力（P<0.05）。Edu试验发现，miR-221模拟物减少了Edu标记的阳性乳腺上皮细胞数量（P<0.01），而miR-221抑制剂增加了Edu标记的阳性乳腺上皮细胞数量（P<0.01），而miR-221抑制剂提高了该基因的活性（P<0.05），表明IRS1是miR-221的一个靶基因。RT-qPCR结果进一步发现，过表达miR-221降低了绵羊乳腺上皮细胞中IRS1和PIK3R1的表达量（P<0.05），沉默miR-221则提高了这2个基因的表达量（P0.05）。【结论】miR-221通过抑制靶基因IRS1的表达量，最终抑制了绵羊乳腺上皮细胞的活力和增殖数量。

本研究旨在建立绵羊瘤胃上皮细胞(Ovine rumen epithelial cells,ORECs)的分离培养、冻存和复苏方法,为反刍动物瘤胃功能的研究和相关瘤胃疾病的发病机制研究提供功能性的细胞模型。以绵羊瘤胃为研究对象,采用胰蛋白酶连续消化法对瘤胃组织进行不同时间(40、30、20、10、10、8和5 min)的消化,并对每次消化后的瘤胃组织和消化液分别进行H.E染色分析和显微镜观察,以确定细胞开始收集及终止消化的时间,最后将收集的瘤胃上皮细胞进行原代培养。在传代培养时,运用差时消化法和差速贴壁法对ORECs进行纯化,并从细胞形态学、细胞生长曲线、角蛋白18(CK-18)免疫荧光染色和上皮细胞标志物E-钙黏蛋白和碱性磷酸酶基因表达等方面对ORECs进行鉴定。然后设置不同体积配方的冻存液,将传代细胞进行冻存,通过检测复苏后的细胞活力和24 h贴壁率确定最佳冻存液配方。结果表明:第4次消化后就基本消化到瘤胃组织的棘层,此时即可开始收集细胞;第7次消化完后瘤胃上皮的基底层细胞基本被消化掉,此时即可终止消化细胞。经纯化后传代的细胞呈现均一的"铺路石"形态,生长曲线明显呈"S"形,且经CK-18免疫荧光染色后鉴定为阳性,同时PCR检测到上皮细胞特异性标志蛋白E-钙黏蛋白和碱性磷酸酶均有表达。此外,ORECs经不同体积配方冻存液冻存复苏后发现,冻存液配方为V_(FBS)∶V_(DMEM)∶V_(DMSO)=9∶0∶1时ORECs的细胞活力及贴壁率最高,且传代后的细胞生长状况良好。因此本试验成功建立了ORECs的体外分离培养、冻存和复苏方法。

分别用5,10和15μg／mL二甲基苯蒽(DMBA)的完全培养液处理体外培养的山羊乳腺上皮细胞36, 24和12 h,再以25 ng／mL佛波酯(TPA)作用2周,研究DMBA和TPA对山羊乳腺上皮细胞的诱导转化作用,确定最佳诱导转化条件,探讨二甲基亚砜(DMSO)对细胞增殖的影响。结果表明,用含15μg／mL DMBA的完全培养液培养12 h,再用TPA连续作用4 d,几乎无山羊乳腺上皮细胞存活,10μg／mL DMBA培养24 h转化效果较差,5μg／mL DMBA培养36 h转化效果最佳;转化的山羊乳腺上皮细胞体积增大、核浓缩、生长排列紊乱、无规则并出现转化灶; DMSO对细胞生长有抑制...

从培养基、细胞接种浓度、冻存液三方面对奶牛乳腺上皮细胞体外培养条件进行了优化。采用台盼兰染色计数方法绘制细胞生长曲线,评定细胞体外生长增殖。结果表明,使用DMEM/F12培养基细胞生长状况最好,DMEM培养的细胞较DMEM/F12生长缓慢,F12其次,RPMI1640培养细胞生长最慢;以1×104的接种浓度于24孔板,细胞生长状态最好,细胞的生长周期经历了潜伏期、对数生长期、稳定期、衰亡期4个生长阶段,生长曲线符合"S"型生长规律;采用胎牛血清(90%FBS+10%DMSO)和培养基(70%培养基+20%FBS+10%DMSO)两种冻存液冻存奶牛乳腺上皮细胞,细胞复苏培养后,胎牛血清冻存的细胞...

应激反应对暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)养殖业危害极大，而皮质醇(Cortisol)是判断鱼类应激反应的重要标志物。肠道是鱼体与外界环境接触的媒介，肠道生理状态能反应鱼体的应激水平，但目前肠道在鱼类响应应激反应中的作用不详。本研究以暗纹东方鲀肠上皮细胞为对象，分别采用胰蛋白酶和DMEM培养基、胰蛋白酶和1640培养基、Ⅰ型胶原酶和DMEM培养基、Ⅰ型胶原酶和1640培养基4种方法对其进行原代培养，旨在建立暗纹东方鲀原代肠上皮细胞体外培养方法，并在此基础上探讨皮质醇对暗纹东方鲀肠上皮细胞氧化应激、细胞凋亡和脂代谢的影响。利用CCK-8法检测肠上皮细胞活力，透射电镜观察皮质醇处理后细胞内线粒体的形态结构，荧光定量PCR (qRT-PCR)检测氧化应激相关基因、细胞凋亡相关基因及脂代谢相关基因在肠上皮细胞内的表达模式，Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡等。结果显示，在4种培养方法中，采用胰蛋白酶消化和DMEM培养基进行培养的肠上皮细胞增殖率最高，贴壁情况最佳；与对照组相比，当皮质醇浓度高于2 000 nmol/L时，肠上皮细胞活力显著下降(P<0.05)；透射电镜显示，所有皮质醇处理组肠上皮细胞内线粒体结构发生改变，线粒体数量增加；随皮质醇处理浓度的升高，肠上皮细胞内氧化应激相关基因(sod、cat和gsh-px)及促凋亡基因(caspase-3、caspase-7、caspase-9、bax和p53)表达量和凋亡指数均显著上升，抗凋亡基因bcl-2表达量显著下降(P<0.05)；脂肪合成相关基因(g6pd、6gpd、pparγ、fas和acc)表达量显著下降，脂肪分解相关基因(hsl、pparα、lpl和cpt-1)表达量显著上升(P<0.05)；TG和TC含量显著下降，NEFA含量显著上升(P<0.05)。结果表明，皮质醇能够促进暗纹东方鲀肠上皮细胞的氧化应激和细胞凋亡，同时促进脂肪的分解并抑制脂肪的合成。本研究以期为暗纹东方鲀抗应激养殖提供一定的参考资料。

【目的】阐明产肠毒素大肠杆菌F18(ETEC F18)引发仔猪腹泻的机理,针对其候选基因FUT1的CDS区第307位点处的突变(G→A),建立3个仔猪小肠黏膜上皮细胞系(GG、GA和AA)。【方法】首先以胎鼠和仔猪为试验材料,确定小肠上皮细胞的最佳分离方法。采用XI型胶原酶和I型中性蛋白酶的联酶混合液,将胎鼠小肠组织机械剪碎后用联酶进行消化和直接将联酶灌注到仔猪小肠腔内消化的两种方法进行比较。针对仔猪小肠黏膜上皮细胞体外培养过程中成纤维细胞污染难以消除的问题,本研究采用局部画圈法逐步去除成纤维细胞。最后,用电镜和CK18免疫荧光染色对纯化后的原代仔猪小肠黏膜上皮细胞进行鉴定。【结果】两种小肠上...

　通过有效的细胞培养方法获得了牛乳腺上皮细胞系,并系统观察了乳腺上皮细胞的长出、贴壁、聚集、迁移、分裂、分化、凋亡等一系列形态变化。结果发现,原代培养的乳腺上皮细胞大多数呈卵圆形,细胞之间连接成片,单层生长,如鹅卵石铺过路面,乳腺上皮细胞和成纤维细胞混生时分区生长,界线明显。传代的乳腺上皮细胞呈岛屿状聚集生长,细胞核呈圆形或椭圆形,核仁2～4枚;在含雌激素的培养液中,细胞出现双核或多核现象,但仍表现一定的接触抑制现象。多次传代后的乳腺上皮细胞含不同的细胞类型,通过光镜观察,部分细胞仍保持较快的分裂增殖能力;部分细胞渐渐分化,出现长形细胞、三角形细胞。上皮细胞增殖分化可形成圆顶型结构,乳腺上皮细...

为探究视黄酸（RA）在鱼类精原干细胞（SSC）增殖与分化中的作用，实验首先以三色荧光报告载体pGRY [延伸因子1α启动子驱动组蛋白H2B-绿色荧光融合蛋白、减数分裂联会复合体蛋白3（Scp3）启动子驱动嘌呤霉素红色荧光融合蛋白、精蛋白启动子驱动黄色荧光蛋白] 转染青鳉精原干细胞系SG3，获得稳转细胞SG3-pGRY，然后分别在2D与3D培养条件下检测RA信号对其增殖与分化的影响。结果显示，稳转细胞SG3-pGRY的红色荧光可监测细胞内源性Scp3的表达，且细胞仍保持干性及分化潜能，表明其可用于监测细胞分化状态。在2D培养条件下，即在细胞培养板中待细胞生长密度约90%就进行传代培养，RA可显著抑制细胞增殖，其受体α、β、γ泛抑制剂BMS493可促进细胞增殖；第48小时，RA处理可下调细胞多能性相关基因pou5f3、klf4表达，上调减数分裂相关基因dazl表达，但对其他减数分裂相关基因如scp3表达无明显影响；第8天，处理组及对照组均未能观察到红色荧光，这与已有报道RA处理体外培养小鼠SSC可显著促进Scp3表达，并进入减数分裂I期偶线期的研究结果明显不同。在3D培养条件下，即用96孔球形低吸附微量培养板进行培养，48小时后细胞成球状体聚集生长，RA、 BMS493处理组、对照组在48 h后均观察到明显红色荧光，减数分裂相关基因表达与2D相比显著上调；第8与第34天，RA处理组减数分裂相关基因表达均显著高于对照组，而BMS493处理组低于对照组。研究表明，RA信号可抑制SG3增殖，促进其分化，但不是诱导细胞发生减数分裂的关键分子。本研究不仅为鱼类SSC分化相关研究提供了良好研究模型，而且促进了对于RA信号在鱼类SSC增殖与分化中作用的深入认识。

【目的】探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和白血病抑制因子(LIF)对小鼠精原干细胞(SSCs)体外增殖的影响,为后续SSCs的诱导分化、转基因动物生产、基因治疗等研究奠定基础。【方法】收集6～8日龄小鼠睾丸,采用机械法和2步酶消化法获得细胞悬液。通过多次差异贴壁法分离纯化SSCs和支持细胞,采用碱性磷酸酶(AP)染色和RT-PCR检测Ngn3和Oct4基因2种方法对SSCs进行鉴定。采用单独添加GDNF(添加量为0,10,20,40ng/mL)或LIF(添加量为0,500,1 000,1 500U/mL)的无血清DMEM/F12培养基培养SSCs,于培养第3,5,7天取样,同时用添加G...

【目的】优化嗜酸乳杆菌对永生化山羊子宫内膜上皮细胞体外黏附的条件。【方法】通过革兰氏染色法,研究山羊子宫内膜上皮细胞的生长状态,嗜酸乳杆菌菌液浓度、菌体生长状态和pH值以及孵育时间对菌体黏附性能的影响。【结果】当山羊子宫内膜上皮细胞培养48 h,嗜酸乳杆菌菌液浓度为1.0×109mL-1,pH值为4.0,孵育时间120 min,嗜酸乳杆菌培养24 h时,嗜酸乳杆菌对山羊子宫内膜上皮细胞的黏附性最好。【结论】永生化山羊子宫内膜上皮细胞作为细菌黏附性能研究的体外模型是有效可行的。

【目的】建立奶山羊乳腺上皮细胞体外培养方法,并对原代和传代细胞进行形态观察。【方法】分别采用组织块法和胶原酶消化法培养奶山羊原代乳腺上皮细胞,然后通过胰酶消化法结合反复贴壁法纯化细胞,免疫组化法鉴定细胞,并利用倒置显微镜观察细胞形态。【结果】组织块法和胶原酶消化法均能培养奶山羊原代乳腺上皮细胞;纯化获得的细胞呈卵圆形或多角形,形成典型的鹅卵石或铺路石样,且细胞角蛋白检测呈阳性;多次传代后乳腺上皮细胞出现分化现象,形态多样,增殖仍然旺盛。【结论】成功建立了一种简单易行、经济而实用的奶山羊乳腺上皮细胞体外培养方法。