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[期刊] 中国农业科学
[作者]
尹彩霞 于少雄 宋琨 李素 杨玉莹 仇华吉
【目的】已有研究显示,猪瘟病毒(CSFV)通过网格蛋白介导的内吞作用侵入宿主细胞,然而参与侵入过程的病毒蛋白尚待阐明。研究旨在明确E2蛋白在CSFV侵入过程中的作用。【方法】通过瞬时转染包装携带E2基因的慢病毒,将慢病毒转导悬浮293细胞构建稳定表达重组E2蛋白的悬浮293细胞系,利用亲和层析的方法纯化重组E2蛋白,同时优化表达时间以增加蛋白产量。利用SDS-PAGE和Western blotting分别鉴定了重组E2蛋白的表达水平及其反应原性。通过感染试验、吸附试验以及内化试验分别探究了E2蛋白对CSFV感染、吸附以及内化的影响。将重组E2蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过阻断ELISA检测血清中多克隆抗体的阻断率。利用制备的多克隆抗体与CSFV感作后进行吸附和内化试验,进一步探究了E2蛋白在介导CSFV吸附和内化中的作用。【结果】通过倒置荧光显微镜观察转导慢病毒后的细胞系,与对照细胞相比可见明显的绿色荧光,表明慢病毒成功转导悬浮293细胞。SDS-PAGE结果显示,在还原和非还原条件下均出现与预期大小相符的蛋白条带,经Western blotting验证,上清中表达的重组E2蛋白能够被抗E2蛋白单克隆抗体WH303所识别,表明构建的悬浮293细胞系能够表达重组E2蛋白。通过优化表达条件,悬浮293细胞培养第8天时上清中重组E2蛋白浓度最高可达5.84μg·m L-1。可溶性蛋白阻断试验结果显示,重组E2蛋白具有阻断CSFV感染的活性。利用重组E2蛋白在病毒入侵过程中处理细胞对CSFV的感染同样具有显著抑制作用;阻断ELISA和中和试验结果显示,针对E2蛋白的多克隆抗体能够阻断CSFV感染,且具有良好的中和活性;吸附试验和内化试验证明,重组E2蛋白处理细胞能够显著抑制CSFV的内化,而利用多克隆抗体与CSFV感作后能够显著抑制其吸附。【结论】E2蛋白参与CSFV吸附和内化。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
徐学清 曹瑞兵 蔡梅红 任雪枫 周斌 陈溥言
对含猪瘟病毒E2蛋白A/D抗原区基因插入的重组酵母菌株进行诱导表达,通过对诱导时间、重组酵母菌株、菌体密度、培养液pH、甲醇剂量等培养条件与表达产量关系的分析,对重组蛋白的表达条件进行了优化。优化后的条件为:28～30℃,225r/min振荡培养至BMGY中菌体OD600值为3.0～3.5时,将菌体转入相当于4倍体积BMGY,pH为6.0的BMMY培养基中培养72h,每24h加入甲醇至终浓度为总体积的0.5%～1.0%。在此优化条件下,重组蛋白的表达量可达275.38μg/mL,比较温度对重组蛋白降解率的影响后发现,培养物上清液应保存于-20℃。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
魏中锋 张彦明 孙裴 张永国 洪海霞 倪斌 郭抗抗
根据已发表的猪瘟病毒基因组序列,设计合成了2对引物,以脾毒和细胞毒总RNA为模板,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、套式聚合酶链式反应(nPCR)及测序技术,对多次动物传代和致细胞病变的猪瘟病毒主要囊膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定,用DNAstar软件比较分析了E2基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性。结果发现,脾毒和标准石门株核苷酸序列的同源性为99.4%,氨基酸序列的同源性为99.0%;细胞毒与标准石门株核苷酸序列的同源性为98.3%,氨基酸序列的同源性为96.7%。由此说明,猪瘟病毒经猪体多次传代和组织培养致细胞病变后,均能保持遗传的稳定性。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
马秋明 张建安 王强 朱小甫 王文江 何维明
根据GenBank公布的猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)Shimen株全基因序列,设计并合成2对引物,用RT-PCR方法对采自陕西省部分地区的30份CSF病料中,CSFV流行毒株的E2基因进行了扩增,并将其克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌DH5α。提取pMD-18T-E2重组质粒,进行BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定,并对阳性质粒进行测序,将测序结果与HCLV疫苗株和shimen株E2基因及E2蛋白进行序列分析。结果表明,从30份病料中共扩增到10株CSFV流行毒株的E2基因;扩增的10株陕西CSFV流行毒株E2基因同源性为92.3%~9...
关键词：
猪瘟 流行毒株 E2基因 序列分析
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
程晓盈 张彦明 王(韦华) 邢福珊 郭抗抗 洪海霞
利用RT-PCR技术扩增出不含信号肽的猪瘟病毒石门株的E2基因,将其克隆到PGEX-T-Easy 载体上,用BamH Ⅰ和HindⅢ进行双酶切,回收目的基因。将目的基因克隆到表达载体质粒pPROEX-HTb中,获得 重组质粒PPRO,EXE2,用pPROEXE2转化大肠杆菌,诱导含重组质粒PPROEXE2的大肠杆菌BL21表达E2基因蛋 白,研究E2蛋白与猪瘟阳性血清反应的特异性。结果表明,受体菌诱导后能表达E2基因蛋白,所表达的E2蛋白能 与猪瘟阳性血清发生特异性很强的反应。
关键词：
猪瘟病毒石门株 E2基因 克隆 表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
田宏 吴锦艳 尹双辉 尚佑军 郑海学 刘湘涛
鉴于猪瘟病毒不能使家兔发病,但能使之产生免疫原性,而且猪瘟兔化弱度苗能在兔体的定型热反应。本研究选用家兔为试验模型,将自制的亚单位疫苗用弗氏佐剂乳化后免疫家兔,持续一定的免疫周期后,用猪瘟活疫苗(II)攻击免疫及对照试验家兔。根据T淋巴细胞增殖试验、阻断ELISA及攻毒保护试验对所制备的抗原进行了全面的评价。结果表明,该免疫原具有良好的免疫原性,而且能保护免疫家兔为4/4。可以进行下一步的开发和利用价值。以期该疫苗能为猪瘟的防治做出贡献。
关键词：
猪瘟病毒 亚单位疫苗 E2蛋白 免疫试验
[期刊] 中国农业科学
[作者]
杨宗岐 李轶女 张志芳 王勇 沈桂芳
【目的】构建猪瘟病毒主要抗原E2基因在百脉根叶绿体基因组中定点转化载体,为百脉根叶绿体的转化及用叶绿体生产动物可直接食用疫苗奠定基础。【方法】通过用BLAST、DNAMAN等分子生物学分析软件对百脉根叶绿体基因组序列进行分析选定同源重组片段,采用PCR、分子克隆技术进行载体构建和鉴定。【结果】在百脉根叶绿体基因组中选择合适的外源基因整合位点,设计引物用PCR扩增叶绿体同源片段,将同源片段克隆后,构建百脉根特异的叶绿体转化载体;构建的百脉根叶绿体定点转化载体pAKE2以扩增的1.35kbpsbA和1.5kbtrnK两段相邻叶绿体DNA为定点整合外源基因的同源重组片段,包含以叶绿体基因特异强启动子...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
徐璐 范学政 王琴 蒋春燕 宁宜宝 王泰健
目的对猪瘟病毒石门株E2基因进行原核表达,以期获得可溶性表达产物,为检测猪瘟抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。方法用PCR技术扩增了重组S21质粒载体上的猪瘟病毒石门株E2基因的4个主要抗原结构域ABCD,A1A2,B和C。分别将4个片段克隆于pMAL-p2X载体中,经PCR、双酶切和测序鉴定,E2基因的4个主要抗原结构域片段的位置、大小和读码框均正确。将4个片段分别转化到表达菌TB1、BL21、BL21-CodonPlus(DE3)-RP和BL21(DE3)中,共得到16株重组表达菌,用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析。结果E2基因的4个主要抗原结构...
关键词：
猪瘟病毒 E2基因 抗原结构域原核表达
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
涂亦娴 张馨玉 金华利 杨福 刘明羽 张富春 王宾
比较猪瘟病毒E2基因的真核表达质粒proVAX-E2n和pVP22-E2n体外表达效率以及体内的免疫效果,以从中选出高效的猪瘟病毒核酸疫苗。将上述表达载体转染Hela细胞进行体外表达后,用RT-PCR和间接ELISA法检测Hela细胞体内和体外表达产物;免疫6~8周龄昆明白小鼠,用间接ELISA法和MTS法检测小鼠血清中CSFV特异性IgG抗体水平以及脾脏中淋巴细胞增殖功能。结果表明2种E2重组质粒均能在Hela细胞中正确表达,且proVAX-E2n的E2蛋白表达量(OD值为0.575 4)明显高于pVP22-E2n(OD值为0.306 05)(P<0.05);proVAX-E2n刺激机体产生...
[期刊] 华北农学报
[作者]
陈柳 余斌 云涛 倪征 华炯钢 李双茂
为了获得具有标记的猪瘟病毒Erns蛋白,通过基因工程操作,使猪瘟病毒Erns基因与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合,用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞中高效表达了ErnsGFP融合蛋白,经Western Blot和荧光显微镜观察证实,表达产物分子量正确,且发出易于检测的绿色荧光,具有标记的Erns蛋白的获得为进一步研究Erns蛋白结构和功能奠定了基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
孙永科 杨玉艾 王养会 李普华 张彦明
用已构建好的表达猪瘟病毒石门株E0基因的重组腺病毒pAd-E0、表达猪瘟病毒石门株E2基因的重组腺病毒pAd-E2以及联合表达猪瘟病毒石门株E0-E2基因的重组腺病毒pAd-E0-E2,肌肉和皮下接种免疫商品猪2次(间隔20 d),同时设非重组腺病毒PAD-CMV、常规猪瘟疫苗和空白对照组。二免21 d后进行CSFV石门株强毒超致死量(1 000倍TCID50)攻击,研究表达猪瘟保护性抗原基因重组腺病毒疫苗的免疫效果。结果表明,pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2免疫组猪的死亡率分别为50%,25%和25%,而常规猪瘟兔化弱毒疫苗免疫组的死亡率为40%,pAd-CMV免疫组和空白对照...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
童超 陈宁 廖迅 袁雪梅 李肖梁 方维焕
【目的】目前使用的基因Ⅰ型猪瘟兔化弱毒C株疫苗是公认的安全、有效疫苗,但近年来基因Ⅱ群的猪瘟流行毒株比例增高,因此对猪瘟(CSF)的有效防控提出了更高要求。本研究旨在通过反向遗传学技术构建适应CSFV基因Ⅱ型的新型C株疫苗,为标记疫苗的开发奠定基础。【方法】在构建的C株感染性克隆基础上,拯救嵌合CSFV基因Ⅱ型HZ1-08毒株E2抗原区的重组C株病毒RecCHZE2,并分析其致病性和免疫原性。【结果】重组嵌合病毒RecCHZE2接种家兔后出现典型的定型热,兔脾脏肿大;重组嵌合病毒RecCHZE2接种猪只后没有发热和明显的白细胞减少,在接种后第12天检测到一过性的病毒血症;对接种猪血清检测结果表...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
周斌 党占国 刘珂 陈溥言
通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增了猪瘟病毒(CSFV)的E0、E2和E012基因并进行了克隆与鉴定。构建了真核表达载体pcDNA-E0、pcDNA-E2和pcDNA-E012,通过与鼠白血病病毒(MuLV)假型病毒构建体系的两种质粒pHIT60和pHIT111瞬时共转染人胚肾细胞(293T),48h后收集假型病毒上清液,将假型病毒上清液超速离心后用抗CSFV的多抗进行Western-blot检测。结果证明E012蛋白能够在假型病毒颗粒表面表达,说明E012能够整合到此病毒粒子表面;用其感染多种宿主细胞,48h后检测发现在猪肾细胞(SK6,PK15)和猪睾丸细胞(ST)上,标记基因...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
许信刚 童德文 刘宏仁
【目的】研制以杆状病毒表面展示系统为基础的猪瘟基因工程亚单位疫苗。【方法】利用杆状病毒表面展示(Baculovirus display)技术,构建展示猪瘟病毒(CSFV)囊膜蛋白的重组杆状病毒BacSC-E0E1E2,该重组杆状病毒带有His6标签,且胞质区域(CTD)和跨膜区域(TM)均来源于杆状病毒囊膜蛋白gp64的CTD和TM。对重组杆状病毒进行Western blot分析、激光共聚焦显微镜观察、免疫金电子显微镜检测、动物免疫试验、血清中和试验。【结果】Western blot分析结果表明,重组杆状病毒中表达了重组E0E1E2蛋白;激光共聚焦显微镜检测结果表明,重组杆状病毒感染昆虫细胞S...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
顾玲 王强 郑月茂 安志兴 马利兵 张涌
为进一步研究基因疫苗的免疫机制与免疫效果,探讨外源基因在乳腺中的定位表达,应用重组PCR方法,将猪瘟病毒(CSFV)E2基因与牛β-乳球蛋白(BLG)5′部分调控序列连接起来,并插入到真核表达载体pEGFP-C1上,构建了含有CSFVE2基因的乳腺特异表达载体。
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