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[期刊] 华北农学报
[作者]
游雷鸣 罗俊 王爱萍 张改平 卜丹 郭亚男 祈艳华
从鸡B淋巴DT40细胞系中克隆-βactin启动子,替换pCDNA3.1(+)载体中的SV40启动子,构建-βactin启动子驱动的Neomycin抗性基因表达框。将克隆的sIgMλ轻链基因两侧各约2 kb的序列插入到抗性表达框的两侧作为同源臂。PCR、酶切以及测序结果表明成功构建了靶向sIgMλ轻链基因的置换型打靶载体pCDNA-act-neo-HR。为建立sIgMλ轻链基因敲除的DT40细胞模型,探究sIgMλ轻链在IBDV感染DT40细胞过程中的作用奠定了基础。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
陈波 闫慧清 李莉 曹海鹏 辛健康 姜山
【目的】为探明PpCASLUU3是否参与灰霉菌引起的小立碗藓中类过敏反应,构建PpCASLUU3-PTN182敲除载体,对早期登陆植物防卫防御的进化提供依据。【方法】根据同源重组的原理,以小立碗藓基因组DNA为模板,利用Primer 5设计的引物,扩增得到小立碗藓PpCASLUU3基因的上、下游同源臂基因片段。将上下游同源臂基因分别克隆到pMD-19T上,测序验证,使用EcoR I、EcoR V酶切含上游目的基因的pMD-19T获得上游目的基因片段,使用BamH I、Sma I酶切含下游目的基因的pMD-19T获得下游目的基因片段,同时酶切PTN182载体,经T_4-DNA连接酶连接,转入大肠杆菌感受态,筛选出阳性克隆,采用相同的方法,将下游臂连入PpCASLUU3.1-PTN182载体。【结果】经PCR检测、酶切验证,获得了完整的PpCASLUU3.1-PTN182-PpCASLUU3.2敲除载体。经测序分析,插入序列PpCASLUU3.1和PpCASLUU3.2与未插入前相似度分别为100%和99.63%。【结论】PpCASLUU3-PTN182敲除载体构建成功。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
赵丽华 梁浩 云亭 李荣凤
【目的】构建两套用于牛肌肉生长抑制素(myostation,MSTN)基因敲除的置换型打靶载体。【方法】设计并合成含有限制性内切酶酶切位点的引物,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)以牛耳皮肤组织基因组DNA为模板分别扩增出两套打靶载体的同源短臂和长臂,再分别插入到两套打靶专用基础载体pMCS-PLP和PⅢ中,构建两套用于牛MSTN基因敲除的置换型打靶载体pPLP-MSTN和PⅢ-MSTN。【结果】经过PCR、T载体连接和DNA测序,证实载体pPLP-MSTN包含2.8 kb同源短臂和4.0 kb同源长臂,载体PⅢ-MSTN包含1.3 kb同源短臂和...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
李东昊 姜玲 刘春林 阮颖
以甘蓝型油菜‘湘油15号’为试材,通过生物信息学分析,运用CRISPR/Cas9系统对Bna SDG8第1个外显子上的Bna SDG8–A和Bna SDG8–C保守序列区域进行CRISPR/Cas9敲除位点设计,构建了CRISPR/Cas9敲除载体p CAMBIA1300–sg RNA/Cas9–Bna SDG8;通过遗传转化,获得转化植株19株;经测序比对,4株植株的Bna SDG8被成功编辑;通过对定向敲除植株开花时间的统计分析,初步确定Bna SDG8参与甘蓝型油菜开花时间的调控。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
陶英杰 刘凤娟 毕春晓 任雪冰 曲瑞红 李科友 徐全乐
【目的】克隆山黧豆β-腈基丙氨酸合成酶基因（CASase）DNA全长序列，构建CRISPR/Cas9敲除载体，为筛选“低毒、高硫”山黧豆品系奠定基础。【方法】以萌发4 d山黧豆幼苗根部为材料，提取其基因组DNA，利用PCR克隆CASase基因全长；经序列同源性、内含子、外显子、sgRNA靶位点和脱靶分析后，在CASase cDNA上选取5个sgRNA靶位点进行寡核苷酸链设计和体外活性检测；从5个sgRNA靶位点中取活性较高的4个sgRNA，利用酶切连接法构建基因敲除载体pPLHACas9-sgRNA20r
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
李今煜 潘智雄 黄天培
以苏云金芽孢杆菌(Bt)库斯塔克亚种(subsp.kurstaki)8010为研究材料,通过PCR技术获得Bt 8010的外孢囊蛋白基因上下游序列,以含有卡那基因的pDG780质粒为中间载体,通过酶切、连接和PCR,构建含外孢囊蛋白基因上游序列、卡那基因、外孢囊蛋白基因下游序列的基因敲除载体pRN5101UKD,为后续外孢囊蛋白基因敲除工作做准备.
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李景芬 于浩 袁野 刘娣
【目的】获得敲除肌肉生长抑制素(MSTN)基因的猪胎儿成纤维细胞。【方法】打靶载体的构建:以Neo为正筛选基因、HSV-tk为负筛选基因。在Neo的两侧分别插入同源长臂和同源短臂。同源长臂5382bp,包含MSTN基因的部分5′端,全部的exon1,intron1和exon2及大部分intron2;同源短臂844bp,包含部分exon3及3′端的部分序列。取35d胎龄的大白猪,用胰酶消化法,分离胎儿成纤维细胞并对其进行培养和建系。采用脂质体法将打靶载体导入胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞采用250μg·ml-1G418筛选7d,再用200μg·ml-1G418+2μmol·L-1GANC维持筛选...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
宋娜 戴青青 宋娜 黄丽丽 韩青梅
【目的】利用反向遗传学方法构建苹果树腐烂病菌(Valsa mali)中表达GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1的敲除载体,通过同源重组的方法进行基因敲除分析目标基因的功能,为全面解析苹果树腐烂病菌致病的分子机制奠定基础,并为有效控制苹果树腐烂病的方法技术和药剂研制提供理论依据。【方法】通过对笔者实验室苹果树腐烂病菌转录组数据的分析比对得到GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1(暂命名),该基因在接种5 d后,在病组织中表现出一定的上调表达,推测该基因可能与苹果树腐烂病菌致病相关。采用Double-joint PCR方法,将目标基因Vmgtp1的上游片段UP、下游片段DOWN及筛选标记潮霉素磷...
关键词：
苹果黑腐皮壳 同源重组 PEG 致病性
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
李今煜 肖水华 黄天培
以苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki)8010为研究材料,通过PCR技术获得Bt 8010菌株NAD(P)H:醌氧化还原酶基因上下游2个片段,以含有卡那霉素抗性基因的pDG780质粒为中间载体,通过酶切、连接和PCR,构建含待敲除NAD(P)H:醌氧化还原酶基因上下游片段、卡那霉素抗性基因的重组质粒pRN5101DKU,为后续Bt8010菌株NAD(P)H:醌氧化还原酶基因的敲除做准备.
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
李海娟
为在噬热栖热菌(Thermusthermophilus)中开収无需筛选标记的基于双交换同源重组的基因无痕敲除手段,以大质粒及染色体上的TTP0042与TTC0340_0341为靶基因,构建含有其两侧同源臂的基因敲除载体幵转化T.thermophilusHB27细胞,将转化混合物涂布于不含筛选物质的培养基上,通过PCR及Southern杂交检验转化子的基因型。结果表明,采用线状的TTP0042基因敲除载体迚行转化,获取表观Δ0042突变体的概率为10–4,而使用闭合环状载体,该概率可达10–3;基因型及表现型分析显示,这些表观Δ0042均为TTP0042无痕敲除型突变体。该敲除手段在染色体上的基因TTC0340_0341中得到验证,从300个单菌落中成功鉴定出了1个Δ0340_0341突变株。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
黄振玉 竹个个 邹华锋 吕为群
细胞周期蛋白M2(CNNM2)是参与体内镁离子平衡的重要候选基因,实验采用的CRISPR/Cas9系统是近几年发展起来的一类新型基因打靶技术。在斑马鱼CNNM2基因的一号外显子处选取打靶位点,构建sgRNA表达载体。随后将体外转录的sgRNA和Cas9 mRNA混合物分别以约30 pg和300 pg的剂量显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中实现对目的靶基因CNNM2的敲除。24~48 h后PCR产物回收,限制性酶切法初步检测基因打靶情况,最后进行测序分析确定突变类型。为进一步验证突变的稳定遗传性,选择了具有敲除效率的F0与野生型斑马鱼进行外交,对获得的F1进行逐一剪尾,提取DNA进行PCR和测序...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
周磊 李东旭 冒魏佳 刘孜斐 时晓丽 高雪 万永杰
[目的]本文利用CRISPR/Cas9系统和先导编辑（PrimeEditor，PE）对湖羊骨骼肌卫星细胞中的肌肉生长抑制素Myostatin（MSTN）基因外显子进行敲除，旨在比较两种技术敲除MSTN基因的效率，并验证新型基因编辑工具PE用于湖羊骨骼肌卫星细胞上的可行性。[方法]针对湖羊 MSTN基因的三个外显子分别设计sgRNA（single guide RNA， sgRNA）以及pegRNA（prime editing guide RNA， pegRNA），构建出相应的质粒，然后，将含有Cas9/sgRNA或PE/pegRNA的质粒共同转染至湖羊骨骼肌卫星细胞中。24 h后观察细胞荧光，48 h后将细胞消化，使用流式细胞分选仪根据荧光强度筛选出转染成功的强阳性细胞，收集细胞获得基因组DNA进行桑格测序，检测两种基因编辑工具对MSTN基因的打靶效率。[结果]成功构建了分别针对湖羊骨骼肌卫星细胞MSTN基因三个外显子敲除的基因编辑工具，质粒测序结果显示序列插入正确；CRISPR/Cas9编辑效率（65%，88%和91%）显著高于先导编辑的编辑效率（57%，29%和33%），而先导编辑的indel比率显著低于常规的CRISPR/Cas9。[结论]在转染效率相近的情况下，常规CRISPR/Cas9相比于先导编辑对于湖羊骨骼肌卫星细胞MSTN基因敲除有更高的编辑效率。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李华玮 王旭英 井汇源 万博 乔宏兴 郭科威 侯文静
旨在利用CRISPR/Cas9系统构建敲除真核翻译起始因子5A(Eukaryotic translation initiation factor 5A,eIF5A)的MARC-145多克隆细胞系，并验证该细胞系对PRRSV感染的影响。针对eIF5A基因构建并筛选成功获得重组慢病毒，用重组慢病毒感染MARC-145细胞，嘌呤霉素及有限稀释法进行筛选，获得敲除eIF5A的MARC-145多克隆细胞系。对构建细胞系进行活力检测，T7E1核酸内切酶、Real-time PCR以及Western blot验证eIF5A体外敲除效率，病毒增殖试验验证该细胞系对PRRSV复制的影响。结果表明：1)细胞活性检测结果显示敲除eIF5A基因对细胞活性无显著影响；2)通过T7E1核酸内切酶、Real-time PCR以及Western blot表明eIF5A表达显著降低，并将此细胞系命名为MARC-145-△eIF5A细胞系；3)使用PRRSV HN07-1感染MARC-145-△eIF5A,体外试验证明敲除eIF5A对PRRSV的增殖有抑制作用。综上，本研究成功构建eIF5A基因敲除的MARC-145多克隆细胞系，体外敲除eIF5A显著抑制PRRSV增殖，这将为进一步探索eIF5A调控PRRSV复制的分子机制奠定基础。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
黄振玉 竹个个 邹华锋 吕为群
细胞周期蛋白Ｍ２（ＣＮＮＭ２）是参与体内镁离子平衡的重要候选基因，实验采用的ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ９系统是近几年发展起来的一类新型基因打靶技术。在斑马鱼ＣＮＮＭ２基因的一号外显子处选取打靶位点，构建ＳｇＲＮａ表达载体。随后将体外转录的ＳｇＲＮａ和ＣａＳ９ ＭＲＮａ混合物分别以约３０ Ｐｇ和３００ Ｐｇ的剂量显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中实现对目的靶基因ＣＮＮＭ２的敲除。２４～４８ ｈ后ＰＣＲ产物回收，限制性酶切法初步检测基因打靶情况，最后进行测序分析确定突变类型。为进一步验证突变的稳定遗传性，选择了具有敲除效率的Ｆ０与野生型斑马鱼进行外交，对获得的Ｆ１进行逐一剪尾，提取ＤＮａ进行ＰＣＲ和测序．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
田李 刘娜 徐荣旗 曲志才 刘乾
【目的】验证大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)非同源末端连接途径关键基因Vdku80的功能,构建高效的大丽轮枝菌基因敲除受体菌株。【方法】利用常规基因敲除的方法,构建大丽轮枝菌Vdku80基因缺失的突变体菌株ΔVdku80。即将Vdku80的同源重组DNA片段(Vdku80的基因组上下游DNA片段之间连接潮霉素抗性基因)通过农杆菌介导的转化转入大丽轮枝菌,通过同源区段的重组,潮霉素抗性基因便会替换掉野生型Vdku80,从而获得突变体菌株ΔVdku80。对突变体菌株ΔVdku80的生物学表型,即生长速率、产孢量和对棉花的致病性进行测试。分别以大丽轮枝菌野生型菌株和ΔVdku8...
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