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[期刊] 中国水产科学
[作者]
曾宪辉 曾令兵 周勇 范玉顶 陈倩 刘文枝 张雪萍 张琳琳
根据大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,GSIV)主衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因序列设计特异性引物,经PCR扩增得到MCP基因编码框1392 bp全长序列,将其定向克隆到真核表达载体pc DNA3.1(+)中,构建重组质粒并命名为pc DNA-MCP。将pc DNA-MCP质粒转染大鲵肌肉细胞系(GS-M),间接荧光免疫染色结果显示,MCP蛋白可在GS-M细胞中表达,且转染后72 h的表达量显著高于转染后48 h;收集转染后72 h的GS-M细胞,经Western blot检测,可检测到MCP蛋白的特异性表达...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
谢昆 严若峰 徐立新 李祥瑞
利用DNA重组技术,分别将柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)pEtK2基因单独或与鸡白细胞介素2基因(IL-2)串联克隆到DNA疫苗载体pVAX1或pcDNA4.0(c)上,构建了pVAX1-pEtK2、pcDNA4.0(c)-pEtK2、pVAX1-pEtK2-IL-2、pcDNA4.0(c)-pEtK2-IL-2 DNA疫苗。酶切鉴定正确后分别将重组质粒胸肌注射14日龄雏鸡,1周后取注射部位肌肉组织,用RT-PCR和Western-blotting法检测保护性抗原的表达情况。结果表明,抗原基因pEtK2和pEtK2-IL-2串联基因均能在注射部位肌肉组织中成功表达。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
严若峰 闫峰宾 王晶晶 徐立新 宋小凯 李祥瑞
根据秀丽新杆线虫等其他几种线虫的肌动蛋白(Actin)开放阅读框(ORF)设计简并引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,合成cDNA,用RT-PCR方法扩增出约为1 100 bp的DNA片段。将该片段克隆到T载体后进行序列测定和分析,结果表明该基因的ORF为1 131 bp,与秀丽新杆线虫、新杆状线虫、肿孔古柏线虫等的同源性高达86%以上,推导出其蛋白质序列含有376个氨基酸,与胎生网尾线虫、秀丽新杆线虫、新杆状线虫、马来丝虫等的肌动蛋白相似性均为98%以上,说明成功克隆了捻转血矛线虫actin基因。将捻转血矛线虫肌动蛋白基因的ORF克隆到pET-28a(+)中,构建了原核表达载体,用IPTG进...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
张馨玉 金华利 杨若耶 肖冲 朱开春 张富春 王宾
以寻求有效DNA疫苗黏膜免疫途径为目的,利用带有负电荷的具有黏膜粘附性多糖-壳聚糖来包裹口蹄疫DNA疫苗pcD-VP1形成纳米级颗粒,用此颗粒经滴鼻、口服、直肠和生殖道4种黏膜免疫小鼠,检测小鼠的针对口蹄疫的体液和细胞免疫水平。结果显示:壳聚糖/pcD-VP1滴鼻免疫小鼠,抗体的高峰来临比只免疫pcD-VP1提前2周,直肠免疫处理中也呈现如此效果;经口服和生殖道途径的免疫,均没有呈现比pcD-VP1免疫组更好的抗体水平。但壳聚糖/pcD-VP1在生殖道和直肠免疫途径里均比pcD-VP1免疫组P.P.结的T细胞增殖水平高。所以,除口服途径以外,在滴鼻、直肠和生殖道免疫中,壳聚糖对质粒的包裹均一定...
关键词：
黏膜免疫 壳聚糖 DNA疫苗
[期刊] 水产学报
[作者]
安利国 傅荣恕 邢维贤 杨桂文
对发生在山东境内的鲤竖鳞病进行了病原学研究，经过病原分离、人工感染实验和细菌学鉴定，确定豚鼠气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｃａｖｉａｅ）是鲤竖鳞病的病原菌。在此基础上，得到了免疫原性较高和生产工艺简单的鲤竖鳞病疫苗。同时，对该疫苗的安全性、免疫保护力和效价等进行了系统研究，并进行了一定范围的口服免疫应用试验。
关键词：
鲤,竖鳞病,豚鼠气单胞菌,疫苗
[期刊] 中国农业科学
[作者]
严若峰 徐立新 孙延鸣 赵光伟 李祥瑞
【目的】构建捻转血矛线虫DNA疫苗,并研究该疫苗对山羊的免疫保护效果。【方法】将捻转血矛线虫重要保护性抗原H11的编码基因分H11-1、H11-2和H11-3三部分,分别亚克隆到基因疫苗载体pcDNA4/HisMaxC中,用酶切反应、序列测定等方法鉴定重组疫苗。将纯化的DNA疫苗肌肉注射山羊后,用RT-PCR、Westernblotting和ELISA方法检测疫苗在山羊体内的转录、翻译和诱导IgG的产生。第2次免疫后2W用10000条捻转血矛线虫第3期幼虫攻击实验动物,检测山羊虫卵排出、虫卵孵化率、成虫数量等免疫保护性指标。【结果】获得了捻转血矛线虫H11DNA疫苗,疫苗第1次免疫7d后在山羊...
关键词：
山羊 捻转血矛线虫 H11 DNA疫苗
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
相权珈 蒲响林 陆明敏 严若峰 徐立新 李祥瑞 宋小凯
[目的]本研究旨在评估巨型艾美耳球虫DNA疫苗候选抗原抵抗巨型艾美耳球虫感染的免疫保护效果。[方法]在之前的研究中，我们从巨型艾美耳球虫（E. maxima）cDNA表达文库中筛选到3个候选抗原EmLPL、EmTregIM-1和EmTregIM-2。本研究中，我们构建真核表达质粒pVAX1-EmLPL、pVAX1-EmTregIM-1和pVAX1-EmTregIM-2，用PLGA纳米颗粒包被所构建的质粒来制备纳米DNA疫苗PLGA-pVAX1-EmLPL、PLGA-pVAX1-EmTregIM-1和PLGA-pVAX1-EmTregIM-2，通过动物免疫攻虫试验观察疫苗的免疫保护效果。[结果]与对照组相比，疫苗免疫均能显著减少球虫感染引起的体重损失和卵囊产量(P < 0.05)。除了pVAX1-EmLPL免疫组外，其它5个免疫组的抗球虫指数（ACI）均在120～160，表明能对巨型艾美耳球虫感染提供部分免疫保护力。其中DNA纳米疫苗组的ACI值均在120以上，高于其对应的裸质粒免疫组。[结论]本研究所构建的3个巨型艾美耳球虫纳米DNA疫苗免疫均能为抵抗巨型艾美耳球虫感染提供免疫保护力。本研究为鸡球虫新型疫苗研发提供候选抗原，为鸡球虫病的免疫防控提供参考。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郭习勤 王栋 王希良 蒋会婷 黄顺军 韩岳 何维明
为了研究鼠疫DNA疫苗pVAX1/F1-V质粒的安全性,试验运用SDS-PAGE电泳和琼脂糖电泳等方法检测了鼠疫DNA疫苗pVAX1/F1-V质粒的纯度,并以小鼠为动物模型进行了质粒pVAX1／F1-V的急性毒性和长期毒性试验,用PCR方法检测外源基因在小鼠组织中的分布情况,用ELISA、EIISPOT方法检测了其自身的免疫反应。结果表明,提取的质粒pVAX1/F1-V未检测到核酸及菌体蛋白污染;注射初期质粒pVAX1/F1-V 主要分布于注射部位的肌肉组织,其他组织有散在分布;小鼠接种4周后,质粒pVAX1/F1-V仅分布于注射部位。小鼠注射pVAX1/F1-V质粒后未产生明显的毒副反应及自...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
江云波 方六荣 肖少波 张辉 陈焕春
目的探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)自杀性DNA疫苗的免疫效果。方法将ORF5和ORF6基因分别插入可以同时表达两个外源基因的表达载体pSCA2的26S启动子下游,获得ORF5和ORF6双基因共表达自杀性DNA疫苗pSFV-56。结果Westernblot检测证实ORF5和ORF6基因获得正确表达,并且所表达的GP5和M蛋白可以形成异源二聚体。将pSFV-56免疫Balb/c小鼠,首免后4周可检测到特异性PRRSV中和抗体,首免后8周的中和抗体最高可达1﹕32,同时还可检测到较高的特异性细胞免疫应答。进一步将pSFV-56免疫断奶仔猪,二免后4周即可产生1:8～1:16的中和抗体,直到...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
魏春华 黄夏玲 杨圆 何乐 林志锋 徐叶 黄文琳 柳开隆 戴爱玲 杨小燕 刘建奎
[目的]利用DNA改组技术(DNA shuffling)对不同谱系的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因进行体外重组,构建具有良好交叉保护作用的DNA疫苗,为研制新型PRRSV疫苗提供参考。[方法]利用DNA改组技术对PRRSV谱系1、3、5.1、8.7毒株的ORF5基因进行体外突变重组,筛选去除信号肽的重组突变体。将重组突变体与真核表达载体pCAGGS-HA连接,构建重组表达质粒并进行酶切和测序鉴定,经脂质体转染MARC-145细胞,利用间接免疫荧光试验(IFA)和Western blotting试验检测目的蛋白的表达情况。将重组质粒pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46(ORF5基因重组的DNA疫苗)免疫小鼠,试验同时设pCAGGS-HA空载体组、PBS空白对照组、弱毒疫苗组(经典弱毒疫苗Ingelvac PRRS MLV,MLV组)和pCA-ORF5-MLV组(ORF5基因来自Ingelvac PRRS MLV),评估其免疫效果。[结果]筛选到2个去除信号肽的重组突变体(ΔORF5-8和ΔORF5-46)。成功构建重组表达质粒pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46,其可在MARC-145细胞中表达GP5蛋白。与pCAGGS-HA空载体组和PBS空白对照组相比,pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46组免疫小鼠血清白介素4(IL-4)和干扰素γ(INF-γ)含量均极显著提高(P<0.01),脾淋巴细胞增殖能力均极显著增强(P<0.01),均能产生针对GP5蛋白的抗体,血清中和试验表明,免疫组小鼠血清能对异源毒株产生交叉中和抗体(抗体平均滴度为10～16)。[结论]重组DNA疫苗pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46均能有效刺激并诱导机体产生细胞及体液免疫应答,具有良好的免疫原性。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
薛春林 茆达干 杨利国 程宝
【目的】探讨CpGDNA对生长抑素DNA疫苗免疫小鼠免疫效果的影响。【方法】生长抑素质粒pES/2SS分别与CpG-ODN、pE-CpG、细菌DNA、脂质体配合免疫小鼠,疫苗剂量为20μg/只,佐剂等量混合,2周后加强免疫。【结果】雌性小鼠免疫后4、6周,疫苗组平均增重显著高于对照组(P
[期刊] 淡水渔业
[作者]
余晓丽 陈明 李莉萍 梁万文 徐增辉 李超 雷爱莹 陈汉忠 甘西
用筛选到的海豚链球菌(Streptococcus iniae)临床分离菌株CMS005,甲醛灭活制备成疫苗并对其进行了注射、浸泡和口服免疫奥尼罗非鱼的效果研究。结果显示:实验室水族箱试验的注射、浸泡和口服免疫的最佳免疫保护率分别为90.5%、61.9%和14.3%,水泥池小网箱试验的最佳免疫保护率分别为100%、86.1%和66.7%。免疫剂量对浸泡免疫效果的影响大于注射和口服免疫,加强免疫可显著提高浸泡和口服免疫效果,超声波处理可以提高浸泡免疫效果。注射和口服免疫7 d和15 d后均可控制罗非鱼海豚链球菌病的继续发生;未免疫组罗非鱼月累计死亡率为4%~16%,而免疫组罗非鱼月累计死亡率低于0...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
吴静 刘振兴 马艳平 梁志凌 马江耀 郝乐 柯浩 冯国清 李玉谷
鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)又称为锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus, KHV),是一种高传染性、致死性病毒。为开发新型CyHV-3 DNA疫苗,前期研究中将CyHV-3 ORF148基因插入pEGFP-N1构建重组质粒,在此基础上,本研究通过转染试验、间接免疫荧光试验证实pORF148-EGFP融合蛋白可以在CCB-J细胞系和建鲤体内表达;将重组质粒作为DNA疫苗,肌肉注射免疫建鲤鱼苗,ELISA检测表明免疫pEGFP-ORF148重组质粒可以显著提高建鲤血清特异性抗体水平; RT-qPCR检测显示,免疫pEGFP-ORF148重组质粒后,建鲤脾脏和头肾中的免疫相关基因如IFN-a1、Mx-1、CXCa、CXCR1、TNF-α、IL-1β及IgM基因表达量均显著提高。攻毒实验显示, CyHV-3攻毒21 d后, PBS组、pEGFP-N1组和pEGFP-ORF148组的建鲤存活率分别为30%、35%和85%,免疫pEGFP-ORF148可以显著提高建鲤的存活率(P
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