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[期刊] 中国农业科学
[作者]
张涛 张丽丽 魏纪珍 肖玉涛 梁革梅 周瑞阳
【目的】通过比较Cry1Ac抗、感棉铃虫昆虫中肠碱性磷酸酶(ALP1)表达量的差异及抗性棉铃虫取食Cry1Ac蛋白对ALP1表达量的影响,分析ALP1表达量变化与抗性的关系,为进一步明确Bt抗性机制、制定抗性治理策略提供理论依据。【方法】利用实时荧光定量PCR技术,比较敏感棉铃虫、Cry1Ac抗性棉铃虫取食含Cry1Ac蛋白的饲料和正常饲料后ALP1表达量的差异。【结果】ALP1在棉铃虫整个发育期都表达,幼虫的表达量最高,蛹期表达量最低,在成虫体内也有较高的表达;ALP1在幼虫中肠表达量最高,其次是后肠、前肠、马氏管,表皮中的表达量最低;与敏感品系相比,对Cry1Ac具有中等水平抗性的棉铃虫A...
关键词：
棉铃虫 Bt 抗性 碱性磷酸酶 表达量
[期刊] 中国农业科学
[作者]
陈琳 魏纪珍 刘臣 牛琳琳 张彩虹 梁革梅
【目的】研究棉铃虫(Helicoverpa armigera)中肠蛋白ABCC1(HaABCC1)与Cry1Ac的结合特性及对Cry1Ac毒力的影响,明确HaABCC1在Cry1Ac杀虫机制中的作用。【方法】分析HaABCC1基因序列,设计引物,通过原核表达得到HaABCC1两个跨膜区片段的蛋白,与Cry1Ac进行Ligand blot试验,验证其与Cry1Ac的体外结合特性;利用RNAi技术干扰棉铃虫幼虫的HaABCC1,在3龄幼虫腹部注射siABCC1,比较HaABCC1的表达量及Cry1Ac处理后棉铃虫死亡率的变化;通过细胞转染将ABCC1导入Sf9细胞系中,确定pAc-ABCC1重组质粒转入Sf9细胞后,用细胞生物测定的方法比较Cry1Ac处理后细胞死亡率的变化;比较敏感品系(96S)和Cry1Ac抗性品系(BtR)棉铃虫的HaABCC1基因全长序列,并通过荧光定量RT-PCR检测HaABCC1在抗、感棉铃虫中的表达量。【结果】HaABCC1跨膜区TMD1和TMD2在Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中成功表达,两个HaABCC1跨膜区片段蛋白均能与活化的Cry1Ac在体外结合;棉铃虫注射siABCC1后,HaABCC1的表达量显著下降,与未注射的棉铃虫、注射DEPC水和siEGFP的棉铃虫相比,用活化的Cry1Ac蛋白处理HaABCC1被干扰的棉铃虫,其幼虫死亡率显著降低,表明棉铃虫幼虫的HaABCC1被干扰后,能显著降低Cry1Ac对棉铃虫的毒力;用活化的Cry1Ac蛋白处理成功转入HaABCC1的Sf9细胞,与对照Sf9细胞相比,细胞的死亡率明显上升,表明将HaABCC1导入Sf9后能显著提高Cry1Ac处理后的细胞死亡率;抗性品系(BtR)与敏感品系(96S)棉铃虫的HaABCC1氨基酸序列没有差别,但抗性品系BtR棉铃虫HaABCC1的表达量显著降低。【结论】HaABCC1是Cry1Ac的特异性结合蛋白,可能是Cry1Ac的功能受体蛋白,并可能参与对Cry1Ac的抗性机制。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
于欢 吕婷婷 李晓峰 王敦
【目的】通过研究棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)感染宿主昆虫后对宿主中肠碱性磷酸酶(ALP)活性与基因表达水平的影响,明确病毒在侵染宿主过程中对宿主昆虫中肠ALP的调控机理。【方法】采用不同剂量的HearNPV感染3龄棉铃虫,测定感染后不同时间昆虫中肠ALP酶活性及其编码基因表达水平,分析病毒感染试虫与未感染健康试虫的ALP活性和编码基因表达水平上的差异。【结果】HearNPV感染后,能够显著抑制ALP的活性,且抑制作用与感染病毒的剂量和感染后时间的增加呈正相关。ALP活性的下降与病毒下调其编码基因ALP的表达水平有关。【结论】HearNPV感染其宿主昆虫的过程中导致宿主ALP活性显著下...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘小民 李杰 郭巍 张霞 李新娜
【目的】克隆棉铃虫中肠羧酸酯酶基因,了解该酶的分子特性,为研究棉铃虫抗药性机理奠定基础。【方法】制备抗血清,对棉铃虫(Helicoverpa armigera(Hübner))中肠cDNA表达文库进行免疫筛选,得到编码棉铃虫羧酸酯酶基因的cDNA克隆,利用生物信息学软件和网站进行序列分析,构建原核表达载体进行表达,并以α-醋酸萘酯溶液为底物进行活性测定。【结果】测序分析表明,羧酸酯酶基因hc3(GenBank登录号:GU119888)全长2 896 bp,编码795个氨基酸。羧酸酯酶HC3的等电点pI为3.94,活性中心包括3个氨基酸残基(催化三联体):Ser204,Glu331,His444...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
常洪雷 梁革梅 王桂荣 于宏坤 吴孔明 郭予元
【目的】将棉铃虫中肠Bt受体蛋白在真核表达系统中成功表达。【方法】用PCR方法分别扩增出对Cry1Ac毒素敏感和抗性棉铃虫的中肠氨肽酶N1(APN1)基因的去信号肽片段,将其克隆至pUC19载体,测定核酸序列后,克隆入Bac-to-Bac表达系统中杆状病毒转移载体pFastBacHTB中多角体基因启动子的下游,筛选出重组质粒pFastBacHTB/APN1并转化大肠杆菌DH10Bac,在体内进行重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组载体Bacmid/APN1。转染粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞(Tn-5B1-4),获得含APN1基因的重组杆状病毒,重组病毒感染Tn细胞后,得...
关键词：
APN 杆状病毒表达载体 Tn 表达
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
周晓梅 沈晋良 高聪芬
用EnvirologixCry1Ab/Cry1Ac平板试剂盒检测了两种转Cry1Ac基因的棉花品系 (NUCOTN33B、NUCOTN99B) 以及常规对照品系 (苏棉 12) 不同生育期主茎嫩叶、侧枝嫩叶、蕾及蕾的苞叶中杀虫蛋白Cry1Ac的含量。结果表明, 两种转Bt基因棉主茎嫩叶杀虫蛋白Cry1Ac的含量随生育期的推移呈明显下降趋势, 花铃期 (NUCOTN33B和NUCOTN99B分别为 4 43和 2 93μg·g-1 ) 和吐絮期 (3 87和 2 86μg·g-1 ) 的含量分别降至苗期第 6叶 (7 64和 8 38μg·g-1 )的 58%、35%和 51%、34%; 相同时...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
崔少勃 丁鲜 张峰
[目的]本文旨在通过建立棉铃虫效应蛋白HARP1体外表达纯化体系，对HARP1蛋白进行体外表达和纯化，为解析HARP1蛋白与植物茉莉酸信号途径中JAZ蛋白的互作分子机制奠定基础。[方法]对harp1基因序列进行密码子优化，使用蛋白预测软件预测HARP1中的信号肽和成熟肽。基于以上信息构建目的蛋白的表达质粒并进行诱导表达，使用亲和层析、酶切、透析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对目的蛋白进行纯化，使用SDS-PAGE和Western blot对蛋白进行分析和检测。[结果]通过优化将harp1基因密码子适应度值(CAI)从0.39提升到0.95。蛋白预测软件预测N末端21个氨基酸为信号肽，信号肽与成熟肽切割位点在第21位丙氨酸和第22位亮氨酸之间，成熟肽为第22位亮氨酸至第122位精氨酸。构建表达质粒pETDuet1-His6-MBP-3C-HARP1(22～122),IPTG能够诱导目的蛋白表达，使用Ni-NTA柱纯化出融合蛋白His6-MBP-3C-HARP1(22～122),3C蛋白酶能够切除His6-MBP标签，使用阴离子交换柱成功分离His6-MBP标签和HARP1(22～122)蛋白，使用Superdex 200 increase Gel Filtration Column进一步纯化获得单体HARP1(22～122)蛋白。[结论]成功建立HARP1蛋白体外表达与纯化体系。
关键词：
棉铃虫 效应蛋白 HARP1 表达 纯化
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
崔少勃 丁鲜 张峰
[目的]本文旨在通过建立棉铃虫效应蛋白HARP1体外表达纯化体系，对HARP1蛋白进行体外表达和纯化，为解析HARP1蛋白与植物茉莉酸信号途径中JAZ蛋白的互作分子机理奠定基础。[方法]对harp1基因序列进行密码子优化，使用蛋白预测软件预测HARP1中的信号肽和成熟肽。基于以上信息构建目的蛋白的表达质粒并进行诱导表达，使用亲和层析、酶切、透析、离子交换层析、凝胶过滤层析等多种手段对目的蛋白进行纯化。使用SDS-PAGE和Western blot对蛋白进行分析和检测。[结果]通过优化将harp1基因密码子适应度值（CAI）从0.39提升到0.95。蛋白预测软件预测N末端21个氨基酸为信号肽，信号肽与成熟肽切割位点在第21位丙氨酸和第22位亮氨酸之间，成熟肽为第22位亮氨酸至第122位精氨酸。构建表达质粒pETDuet1-His6-MBP-3C-HARP1(22-122)，IPTG能够诱导目的蛋白表达，使用Ni-NTA柱纯化出融合蛋白His6-MBP-3C-HARP1(22-122)，3C蛋白酶能够切除His6-MBP标签，使用阴离子交换柱成功分离His6-MBP标签和HARP1(22-122)蛋白，使用Superdex 200 increase Gel Filtration Column进一步纯化获得单体HARP1(22-122)蛋白。[结论]成功建立HARP1蛋白体外表达与纯化体系。
关键词：
棉铃虫 效应蛋白 HARP1 表达 纯化
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
许雄山 韩召军 王荫长
以对有机磷杀虫剂敏感的品系(SS) 和抗性的品系(R2) 为试虫材料, 利用生测和生化分析两种方法研究了羧酸酯酶在棉铃虫对有机磷杀虫剂抗性形成中的作用。结果表明: TPP对久效磷、辛硫磷的增效比在R2品系中分别为2.76 和2.46倍, 在SS品系中分别为1.85 和1.48 倍; 两品系羧酸酯酶的Km 和Vm ax之间存在显著的差异, R2 和SS品系羧酸酯酶的米氏常数Km 、Vm ax分别为76.74 μm ol/L、56.29 nm ol/ (m in·m g) 和107.39 μm ol/L、44.40 nm ol/ (m in·m g); 两品系的羧酸酯酶对TPP、久效磷和辛硫磷的抑...
关键词：
棉铃虫 羧酸酯酶 有机磷杀虫剂 抗性机制
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
刘小侠 汪飞 徐静 张青文 封红兵 宋荣
20 0 0— 2 0 0 1年在新疆喀什叶城县研究了转 Bt基因棉 MD- 80不同发育阶段对棉铃虫的抗性表达和棉田节肢动物群落。结果表明 :1)转 Bt基因棉棉叶对棉铃虫初孵幼虫有 2个抗性高峰即 5月中下旬和 7月底 ,抗虫性分别为 94 .5 %和 83.3% ,8月份抗性最低 (2 2 .7% ) ,而河南的研究表明 8月份正是第 2个抗性高峰 ,抗虫效果高达 93. 8% ;2 ) 7月上旬棉株不同器官抗棉铃虫的强弱依次为 :棉苞叶 (96 .7% )、棉蕾(74 .2 % )、花瓣 (6 0 % )、棉叶 (5 0 .2 % )、棉铃 (30 % )、花蕊 (2 6 .8% ) ...
关键词：
棉铃虫 转Bt基因棉 抗性表达 群落
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
王沫 谭福杰 尤子平
以羧酸酯酶抑制剂磷酸三苯酯（ＴＰＰ）和多功能氧化酶抑制剂增效醚（ＰＢＯ）以及￣（１４）Ｃ－氰戊菊酯为材料，选择对氰戊菊酯具有不同抗性程度的棉铃虫自然种群为试虫，研究其抗性机理。结果表明：棉铃虫对氰戊菊酯的抗性与其体内酯酶活性无关，而与多功能氧化酶活性直接相关；同时，表皮对氰戊菊酯的渗透性降低也是棉铃虫对氰戊菊酯产生抗性的强化因子。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
吴益东 沈晋良 谭福杰 尤子平
对于室内选育的棉铃虫抗性品系（ＹＧ－Ｒ，Ｒｄ）和采自田间的抗性种群（ＹＧ９２２１，ＹＧ９２４１，ＹＧ９３２１），ＰＢＯ对氰戊菊酯都具有明显的增效作用，增效比为１９．５～１６９．５倍，而ＤＥＦ和ＴＰＰ对氰戊菊酯几乎没有增效作用。Ｒｄ抗性品系三龄幼虫多功能氧化酶艾氏剂环氧化活力是ＹＳ－Ｓ敏感品系的１．３６倍，而ＹＧ－Ｒ和Ｒｄ两个抗性品系分别与ＹＳ－Ｓ敏感品系相比，三龄幼虫酯酶活力没有差异。因此，多功能氧化酶解毒作用增强是棉铃虫对氰戊菊酯产生抗药性的主要因子，而酯酶与抗性无关。用１４Ｃ－氰戊菊酯进行的表皮穿透研究表明，氰戊菊脂在抗性品系和敏感品系的表皮穿透速率上存在差异，表皮穿透速率降低是棉铃虫对氰...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
王智健 牛长缨
检测紫外光(ultra violet,UV)照射后棉铃虫HMG-CoA还原酶基因、卵黄原蛋白基因的表达量及棉铃虫产卵量的变化。提取经UV照射后棉铃虫雌虫的总RNA并反转录为cDNA。利用荧光定量PCR(qPCR)技术检测HMG-CoA还原酶基因及卵黄原蛋白基因的表达量。UV照射后,统计棉铃虫雌虫的产卵量。结果表明:UV照射0.5~5.0 h,棉铃虫HMG-CoA还原酶基因的表达量显著增加;UV照射1.0~5.0 h,24 h后取样发现棉铃虫卵黄原蛋白基因的表达量显著增加;UV照射1.0~4.0 h,棉铃虫雌虫的产卵量显著增加。研究结果证实UV照射能影响棉铃虫hmgr、vg的表达量和雌虫的产卵量...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
吴益东 杨亦桦 陈进 沈晋良
测定了氰戊菊酯和顺式氰戊菊酯对不同棉铃虫品系３龄幼虫的毒力。结果表明，两者对敏感品系的ＬＤ５０值相差８．７倍，而对一系列抗性品系两者ＬＤ５０值相差２４．３～１７２．１倍；不同棉铃虫品系对氰戊菊酯和顺式氰戊菊酯的抗性水平也存在显著差异，对氰戊菊酯的抗性为８１．８～２１４２．８倍，对顺式氰戊菊酯的抗性为２３．８～１６４．６倍。用室内选育的山东阳谷Ｓ６抗性品系进行测定，结果显示，增效醚对氰戊菊酯和顺式氰戊菊酯的增效比分别为１１９．３和４．３，说明棉铃虫对两者的氧化代谢抗性机制差异很大。氰戊菊酯和顺式氰戊菊酯对棉铃虫的毒力以及棉铃虫对两种药剂的抗性水平并不是简单的４倍关系，氰戊菊酯中大量无效异构体的存...
关键词：
棉铃虫 氰戊菊酯 顺式氰戊菊酯 抗药性
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
任晓霞 韩召军 王荫长
用久效磷对采集于山东聊城抗性地区的棉铃虫Helicoverpaarmigera (H櫣ｂｎｅｒ)进行抗性品系选育。经过 10代的室内选育 ,抗性倍数达 2 11 88倍 ,为选育前的 6 6 7倍。同时发现筛选后对氰戊菊酯、氯氰菊酯和灭多威的抗性分别下降了8 13,7 44和 13 36倍 ,对甲基对硫磷和辛硫磷的抗性基本保持不变。这说明久效磷与其他 5种被试药剂之间没有明显的交互抗性。还对抗、感棉铃虫体内AChE进行了研究 ,对久效磷抑制粗酶液的实验表明 ,抗性品系棉铃虫体内AChE的I50 是敏感品系的 3 18倍。酶液纯化使抗、感品系AChE的I50 分别下降 6 6 9和 3 49...
关键词：
棉铃虫 久效磷 乙酰胆碱酯酶 抗药性
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