[目的]本试验旨在分析脂肪自分泌因子Chemerin在牛肌内成熟脂肪细胞脂解中的作用及调控机制。[方法]体外培养牛肌内成熟脂肪细胞,采用油红O染色与抽提法检测成熟脂肪细胞脂解过程中脂肪含量变化,通过比色法测定细胞中甘油及游离脂肪酸的释放量;采用RT-q PCR及Western blot技术分析脂解关键基因PPARα、LPL与HSL mRNA及蛋白的表达情况。[结果]在牛肌内成熟脂肪细胞脂解过程中,细胞中Chemerin及其受体CMKLR1 mRNA表达量显著降低(P<0.01)。[结论]Chemerin通

用不同种类、不同浓度游离脂肪酸(FFA)处理体外培养的成熟3T3-L1脂肪细胞,实时荧光定量PCR和Western-blotting分析FFA处理前后脂联素基因mRNA和蛋白质水平的表达差异。结果表明:各类脂肪酸对脂联素mRNA的表达均具有下调作用,且抑制效应呈时间、剂量依赖性;并且各种脂肪酸显著地影响脂联素蛋白的分泌作用。

【目的】拟通过腺病毒介导的超表达及siRNA干扰试验，分析lncFAM200B对牦牛肌内脂肪细胞脂质沉积的影响，为解析lncFAM200B对牦牛肌内脂肪细胞脂质沉积的调控机制奠定基础。【方法】采集牦牛背最长肌组织，采用酶消化法和差速贴壁法分离牦牛肌内前体脂肪细胞；构建包装lncFAM200B超表达腺病毒，设计合成其siRNA干扰序列；通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析lncFAM200B超表达与干扰后脂肪分化标志基因PPARγ、C/EBPα、AP2,lncFAM200B潜在靶基因SIRT1、PTEN的表达水平；采用油红O染色、甘油三酯（TAG）测定、CCK-8检测等方法检测细胞内脂滴沉积情况、甘油三酯含量变化及细胞增殖情况。【结果】从牦牛背最长肌成功分离获得肌内前体脂肪细胞；lncFAM200B超表达后，脂肪分化标志基因C/EBPα、AP2表达量显著升高（P<0.05），随着诱导分化时间的增加，lncFAM200B潜在靶基因SIRT1表达量呈先降低后升高的趋势，PTEN表达量呈现先增高后降低趋势；细胞脂滴沉积显著增加（P<0.05），降低细胞脂肪沉积，且诱导分化第6天细胞内甘油三酯含量显著降低（P

获得高质量的RNA是逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、Northern blot以及转录组测序(RNA-Seq)等分子生物学研究的基础,由于草鱼脂肪细胞中油脂含量较高,从中提取高质量RNA存在困难。本研究以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)成熟脂肪细胞为材料,通过增加离心和抽提次数等方式对传统总RNA提取方法进行优化,采用琼脂糖凝胶电泳、核酸定量分析及基因扩增等方法验证所得RNA的完整性、纯度及质量。结果表明,经此方法提取的草鱼成熟脂肪细胞总RNA的A260 nm/A280 nm比值在1.95到2.00之间,28S和18S条带完整,草鱼LPL和β-actin基因扩增条...

为分析山羊KLF16对肌内前体脂肪细胞分化的调控作用,利用RT-PCR克隆得到山羊KLF16基因序列,利用生物信息学分析山羊KLF16基因序列特征,通过过表达、油红O染色和qPCR等方法从形态学及分子水平分析过表达山羊KLF16后肌内脂肪细胞脂滴积聚及分化标志基因表达水平的变化。结果表明:1)克隆得到包含CDS区的山羊KLF16基因序列986bp,编码251个氨基酸,具有典型锌指结构;2)KLF16在山羊各组织广泛表达,其中腹部皮下脂肪组织表达量极显著高于其他组织(P<0.01);3)过表达山羊KLF16与对照组相比脂肪细胞脂滴积聚减少,分化标志基因PPARγ和PPARα极显著下调(P

[目的]本试验旨在探讨脂肪因子Chemerin在牛卵巢颗粒细胞凋亡与自噬中的作用。[方法]体外培养牛卵巢颗粒细胞并用重组Chemerin蛋白(0.2μg·mL~(-1))处理24 h,采用流式细胞术和CCK-8检测细胞凋亡,通过免疫荧光检测细胞中活性氧(ROS)含量变化,测定细胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量;RT-qPCR分析凋亡与自噬相关基因Bax、Bcl-2、Caspase-3、P62和Atg7 mRNA表达,Western blot技术检测凋亡与自噬相关蛋白表达情况。[结果]与对照组相比,Chemerin处理卵巢颗粒细胞后,细胞中ROS和MDA含量显著上升(P<0.05),SOD和GSH-px活性极显著降低(P<0.05)。[结论]Chemerin可通过调控相关基因的表达诱导牛卵巢颗粒细胞凋亡并伴随自噬的发生。

［目的］本文旨在研究核受体共激活蛋白２（ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ ２，ｎｃｏａ２）对猪肌内前体脂肪细胞分化能力的影响。［方法］用荧光定量ｐｃｒ（ｑｒｔ－ｐｃｒ）法检测ｎｃｏａ２在猪肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达变化；通过ｎｃｏａ２小干扰ｒｎａ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｒｎａ，ｓｉｒｎａ）抑制内源ｎｃｏａ２的表达，并用油红ｏ染色检测沉默ｎｃｏａ２对肌内前体脂肪细胞分化能力的影响，通过ｑｒｔ－ｐｃｒ检测沉默ｎｃｏａ２对脂肪分化关键基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒγ，ｐ．．．

为探究干扰叉头转录因子O1(Forkhead box protein O1, FOXO1)对牛前体脂肪细胞增殖和分化的作用，本研究以固原黄牛的前体脂肪细胞为研究对象，采用组织块法分离牛前体脂肪细胞，并利用表型鉴定和标志基因表达谱2种方法鉴定所分离细胞的纯度和分化潜能。筛选并包装牛FOXO1干扰慢病毒，利用EdU染色、流式细胞术、油红O染色和qPCR方法探究干扰FOXO1对牛脂肪细胞增殖和分化的作用。结果表明：1）成功分离了牛前体脂肪细胞，且其具有较高的纯度和分化潜能。2)EdU染色结果表示，侵染Lv-FOXO1极显著增加了牛脂肪细胞的增殖率（P<0.01）。3）流式周期结果显示，干扰FOXO1显著增加了牛脂肪细胞S期阳性细胞的比例，促进了G1/S期的转化，进而促进了牛脂肪细胞增殖。4）干扰FOXO1后，增殖标志基因PCNA、CDK1和CDK2的表达量均极显著上调（P<0.01）。5）干扰FOXO1后牛前体脂肪细胞脂滴生成明显减少，且成脂标志基因PPARG的表达极显著下调（P<0.01）,CEBPB和LPL的表达显著下调（P<0.05）。综上，干扰FOXO1可通过上调增殖标志基因PCNA、CDK1和CDK2的表达促进牛脂肪细胞G1/S期的转化，进而促进牛脂肪细胞增殖，且其可通过降低成脂标志基因PPARG、CEBPB和LPL的表达减少牛脂肪细胞脂滴形成，进而影响脂肪沉积。本研究可为中国地方黄牛的肉质遗传改良提供理论依据。

【背景】脂肪酸转运蛋白1(FATP1)能够促进哺乳动物脂肪酸摄取，该过程对维持机体脂代谢平衡十分重要，也对家畜的肉质好坏有着重要影响。【目的】通过获得山羊FATP1的CDS区序列，检测该基因在山羊不同组织中的表达量，探究其对山羊肌内脂肪细胞脂质代谢的影响，为进一步揭示FATP1在山羊脂代谢中的作用机制提供参考，为山羊的遗传育种改良提供理论依据。【方法】利用RT-PCR方法克隆获得山羊FATP1的CDS区序列，利用在线工具分析其亲疏水性、跨膜区域、信号肽等生物学特性，并构建其氨基酸序列系统进化树。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测FATP1在山羊不同组织中的表达水平，构建其组织表达谱。利用构建的真核表达载体和筛选出的siRNA对山羊肌内脂肪细胞进行FATP1过表达和干扰处理，通过油红O染色和甘油三酯测定检测FATP1过表达和干扰后对山羊肌内脂肪细胞脂质沉积的影响，并通过RT-qPCR技术进一步探究该基因过表达和干扰后对脂质代谢相关基因表达的影响。【结果】克隆获得了FATP1CDS区1 941bp，共编码646个氨基酸残基，预测其分子式为C_(3196)H_(5026)N_(884)O_(898)S_(25)，推测该蛋白为碱性疏水稳定蛋白。三级结构预测显示，山羊与绵羊的FATP1蛋白质三级结构相似，而与牛的FATP1蛋白质三级结构略有不同。氨基酸序列系统进化树分析显示，山羊FATP1与绵羊亲缘关系最近。RT-qPCR检测发现FATP1在山羊小肠中表达量最高。油红O染色及甘油三酯测定表明过表达FATP1后山羊肌内脂肪细胞内脂滴数量增多，脂质含量增加，而干扰FATP1后则得到了相反的结果。进一步检测脂质代谢相关基因的表达变化，发现在山羊脂肪细胞中过表达FATP1后，脂肪酸合成、转运等相关基因AGPAT6(P<0.01)、PLIN1(P<0.01)、DGAT2(P<0.01)、FADS2(P<0.01)、FADS1(P<0.01)、ACSL1(P<0.01)及ELOVL3(P<0.05)的表达水平显著升高，而脂解相关基因ACOX1(P<0.01)的表达水平则显著降低；干扰FATP1后，脂肪酸转运、延长等相关基因SCD5(P<0.01)、FABP3(P<0.05)的表达量显著下降，脂解相关基因ACOX1(P<0.01)和CPT1B(P<0.05)的表达量显著上升。【结论】FATP1可能通过促进细胞脂质生成相关基因的表达，降低脂质降解相关基因的表达，从而显著促进山羊肌内脂肪细胞脂质的沉积，这些结果为进一步揭示FATP1在调控脂质代谢中的作用及分子机制提供了试验参考。

【目的】探究bta-miR-33b对牛前体脂肪细胞分化的作用,并对此过程中潜在的靶基因进行验证。【方法】分离培养秦川牛前体脂肪细胞并进行诱导分化,PCR检测bta-miR-33b在前体脂肪细胞分化过程中的时序表达。对牛前体脂肪细胞体外转染bta-miR-33b的mimic、mimic negative control (mimic NC)、inhibitor、inhibitor negative control (inhibitor NC)进行诱导分化培养,于分化培养的不同时间取样,检测脂肪细胞分化标志基因(过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因、CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)基因、脂肪酸结合蛋白4(FABP4)基因)的mRNA表达量及甘油三酯和脂滴含量。预测bta-miR-33b的靶基因,并通过双荧光素酶报告系统验证靶向关系、Western Blot检测靶蛋白的表达量。【结果】在秦川牛前体脂肪细胞分化过程中,bta-miR-33b的表达量呈下降趋势。在前体脂肪细胞分化过程中,bta-miR-33b mimic可抑制脂肪分化标志基因的表达,降低细胞中甘油三酯和脂滴的含量; bta-miR-33b inhibitor可促进脂肪分化标志基因的表达,提高甘油三酯和脂滴的含量。高迁移率族蛋白A2(High mobility group AT-hook 2,HMGA2)基因、扭曲相关蛋白(Twist family bHLH transcription factor 1,TWIST1)基因是bta-miR-33b的靶基因;脂肪细胞分化过程中,bta-miR-33b能够调控HMGA2和TWIST1蛋白水平的表达。【结论】bta-miR-33b对秦川牛前体脂肪细胞体外分化具有抑制作用;HMGA2和TWIST1是bta-miR-33b的靶基因。

【目的】建立牛前体脂肪细胞的体外分离培养方法,研究牛前体脂肪细胞的生物学特性和分化特征,为研究牛脂肪发育和脂肪沉积的机制提供一种简便有效的细胞模型。【方法】采用Ⅰ型胶原酶消化法自新生牛脂肪组织中获得前体脂肪细胞,对培养的牛前体脂肪细胞进行形态学观察、生长曲线测定、油红O染色及脂肪细胞标志基因LPL、PPAR-r和脂联素表达研究。【结果】80%的牛前体脂肪细胞接种后12h开始贴壁,4d后开始向脂肪细胞转化,10d后绝大部分细胞脂滴融合,细胞脂肪含量增加;分离的牛前体脂肪细胞接种后1~2d生长缓慢,3~8d进入对数生长期,9d后进入平台期,之后细胞数目开始下降。经胰岛素诱导分化过程中,LPL在牛前...

［目的］探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒγ，ｐｐａｒγ）在肌内和皮下脂肪细胞中的差异表达及其与脂质差异沉积的关系，并从ｍｉｒＮａｓ角度阐述ｐｐａｒγ基因差异表达的机制。［方法］用油红ｏ染色法检测肌内前体脂肪细胞与皮下前体脂肪细胞的分化聚脂能力；采用ｑｒｔ－ｐｃｒ与ＷｅｓｔｅｒＮ ｂｌｏｔ检测ｐｐａｒγ在肌内脂肪细胞和皮下脂肪细胞中的表达水平；通过生物信息学预测靶向ｐｐａｒγ的ｍｉｒＮａｓ，利用ｑｒｔ－ｐｃｒ检测候选ｍｉｒＮａｓ在肌内脂肪细胞和皮下脂肪细胞中的表达水平；用双荧光素酶报告系统鉴定候选ｍｉｒＮａｓ与．．．

【目的】探讨烟酰胺(nicotinamide,NIC)和罗格列酮(rosiglitazone,RSG)对猪前体脂肪细胞凋亡的作用及分子机制,寻找通过凋亡方式调控脂肪细胞数目进而控制生脂的新途径。【方法】分别用含有0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol·L-1RSG的培养基处理猪前体脂肪细胞,在处理后的48 h,对不同处理组细胞进行Hoechst33258和Annexin-V-FITC/PI染色以观察细胞形态,流式细胞仪分析细胞凋亡情况;并收集细胞总蛋白,用Western blotting方法检测细胞凋亡关键基因的蛋白表达水平;基于RSG促凋亡的浓度梯度结果,选用1.0mmol·L...

【目的】肉牛肌内脂肪沉积与牛肉的风味、多汁性和嫩度密切相关。脂肪沉积过程表现为脂肪细胞的增殖（数量增多）和分化（脂质生成），受到了多基因协同调控。前人研究发现，小鼠中Snail1可以参与肌肉发育和脂质稳态调控，但其在牛脂肪生成过程中的作用仍未知，有待进一步研究。【方法】以秦川牛为研究对象，克隆得到Snail1 CDS区序列，构建Snail1时空表达谱，运用生物信息学软件对其功能结构及靶基因进行预测。进一步，通过RNAi干扰结合CCK8、EdU、细胞流式及实时荧光定量PCR等方法探究Snail1对牛脂肪细胞增殖的影响。【结果】秦川牛Snail1与NCBI公布序列相比存在2处碱基同义突变，其在秦川牛新生牛肺、肾周脂肪、小肠呈现较高丰度表达；而在成年牛中，Snail1在肾周脂肪组织中的表达量最高，背最长肌中的表达量次之，肺脏组织中的表达量最低。生物信息学分析发现，Snail1启动子区存在1个651 bp CpG岛及C/EBP、PPARα等与脂肪生成相关的转录因子结合位点。CKⅠ(Ser92/96)、CKⅡ（Ser25/119,Thr89）、CDK1(Ser13/104/112/119/143/183/214/221)、CDK5(Ser105/107）等多个细胞周期相关激酶可能参与了Snail1蛋白的磷酸化修饰。通过对牛已注释基因启动子区提取、靶基因预测及KEGG动态网络构建发现，成脂相关的MAPK、PI3K-Akt、mTOR等信号通路为Snail1参与脂肪生成相关的潜在节点信号通路。进一步，通过RNAi干扰试验对其功能研究表明，Snail1下调促进了牛前体脂肪细胞的增殖，增加了复制期阳性细胞的比例（P<0.01）且促进了G1/S细胞周期转换。RT-qPCR和Western-blot检测表明，干扰Snail1显著上调了促增殖调控基因CCNB1、CCND2、CDK2、CDK4(P<0.05)和蛋白的表达。【结论】Snail1在新生牛肾周脂肪及成年牛肾周脂肪和背最长肌中表达量相对较高。干扰Snail1促进了牛前体脂肪细胞的增殖、G1/S细胞周期转变和CCNB1、CCND2、CDK2、CDK4等增殖相关基因表达；CKⅠ、CKⅡ、CDK1/5等多个细胞周期相关激酶可能通过磷酸化修饰Snail1蛋白进而参与细胞增殖调控，而MAPK、PI3K-Akt、mTOR等为Snail1影响牛脂肪细胞增殖潜在的关键节点通路。研究结果为进一步探究Snail1参与牛脂肪生成作用机制奠定了基础。

旨在克隆牦牛诱导细胞凋亡DNA片段化45样效应因子A(CIDEA)基因序列、分析其生物学特性及检测CIDEA基因在牦牛不同组织及脂肪细胞分化中的表达模式。以金川牦牛皮下脂肪组织的cDNA为模板,采用PCR技术克隆CIDEA基因的CDS序列(Coding sequence),对CDS区进行相关的生物信息学分析;设计特异引物,检测该基因在金川牦牛肺脏、心脏、肾脏、脂肪等组织的表达情况;同时分离原代前体脂肪细胞,分析CIDEA基因在脂肪细胞分化过程中的表达趋势。结果表明,金川牦牛CIDEA基因的序列长度为696 bp,其中CDS序列为684 bp,编码227个氨基酸;金川牦牛CIDEA基因与普通牛的同源性最高,核苷酸序列同源性为94.14%,氨基酸序列同源性为99.54%,与鸡的同源性最低,核苷酸序列同源性仅为63.38%,氨基酸序列同源性仅为59.05%,利用MEGA 5.0软件构建进化树显示金川牦牛与牛的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远。蛋白理化性质分析结果表明,CIDEA蛋白是一个不稳定的碱性亲水蛋白,不存在跨膜结构与信号肽;二级结构预测显示CIDEA蛋白中α螺旋占33.92%,无规则卷曲占51.98%。实时荧光定量PCR结果表明,CIDEA基因在金川牦牛脂肪组织中表达量最高,肺脏中表达量最低;在金川牦牛脂肪细胞分化过程中呈现上升的趋势。由此可推测金川牦牛CIDEA基因可能参与牦牛脂肪细胞分化与脂肪沉积。