[目的]本文利用CRISPR/Cas9系统和先导编辑（PrimeEditor，PE）对湖羊骨骼肌卫星细胞中的肌肉生长抑制素Myostatin（MSTN）基因外显子进行敲除，旨在比较两种技术敲除MSTN基因的效率，并验证新型基因编辑工具PE用于湖羊骨骼肌卫星细胞上的可行性。[方法]针对湖羊 MSTN基因的三个外显子分别设计sgRNA（single guide RNA， sgRNA）以及pegRNA（prime editing guide RNA， pegRNA），构建出相应的质粒，然后，将含有Cas9/sgRNA或PE/pegRNA的质粒共同转染至湖羊骨骼肌卫星细胞中。24 h后观察细胞荧光，48 h后将细胞消化，使用流式细胞分选仪根据荧光强度筛选出转染成功的强阳性细胞，收集细胞获得基因组DNA进行桑格测序，检测两种基因编辑工具对MSTN基因的打靶效率。[结果]成功构建了分别针对湖羊骨骼肌卫星细胞MSTN基因三个外显子敲除的基因编辑工具，质粒测序结果显示序列插入正确；CRISPR/Cas9编辑效率（65%，88%和91%）显著高于先导编辑的编辑效率（57%，29%和33%），而先导编辑的indel比率显著低于常规的CRISPR/Cas9。[结论]在转染效率相近的情况下，常规CRISPR/Cas9相比于先导编辑对于湖羊骨骼肌卫星细胞MSTN基因敲除有更高的编辑效率。

【背景】肌肉系统是维持动物体生存生长的重要基础，在哺乳动物肌肉中，将近一半的肌肉为骨骼肌，骨骼肌通过细胞繁育增殖到迁移融合，逐步形成了具有收缩能力的附着在骨骼上的成熟肌束。在机体内，骨骼肌不仅参与动物生长，也参与呼吸、代谢等生理活动。目前许多研究表明，lncRNA具有调控肌肉生长发育的作用，是影响骨骼肌功能、疾病的关键因子。但由于lncRNA作用机制复杂，方式多样，在物种间保守型很低，故不同种属动物lncRNA之间作用关系不大，且大多数研究存在于人和小鼠等生物体内，而对牛肌肉生长影响的研究内容极少。近年来，人们发现lncRNA会与某些靶基因相互作用，进而调控肌肉细胞的发生过程。【目的】在前期采集不同月龄不同组织部位的牛肌肉，进行高通量测序，获得高表达差异的lncRNA，在对其调控成肌过程进行机制研究的基础上，探究长链非编码RNA lnc721与其靶基因MMP9的互作关系，以及MMP9对牛骨骼肌细胞生长发育的影响，以期为牛骨骼肌发育调控机制的研究提供参考。【方法】前期试验发现干扰lnc721对牛骨骼肌卫星细胞增殖具有正调控作用，且对其分化具有负调控作用。为了进一步探究lnc721对牛肌肉发育的调控通路。分别在牛骨骼肌卫星细胞的分化期设置了3个干扰lnc721牛骨骼肌卫星细胞组，与3个对照组采用NGS技术进行转录组测序，以期获得lnc721差异靶基因，进一步研究lnc721对牛骨骼肌发育的调控通路。根据筛选结果以及qRT-PCR的验证结果，试验选取MMP9作为lnc721的靶基因，并通过CatRAPID网站对lnc721与MMP9结合能力进行预测。设计并合成lnc721及MMP9干扰序列，转染至牛骨骼肌卫星细胞中，通过qRT-PCR、Western blot技术在mRNA水平与蛋白质水平分析下调lnc721对MMP9表达情况的影响。并且通过下调MMP9，采用qRT-PCR、Western blot与EdU技术检测增殖标志因子Ki67、Pax7以及分化标志因子MyHC与MyOG的表达情况，以反映下调MMP9对牛骨骼肌卫星细胞生长发育的影响。【结果】CatRAPID结果显示，lnc721与MMP9结合倾向为0.75，共有9个结合位点，二者存在互作结合。干扰lnc721之后，采用qRT-PCR分析，结果表明在细胞增殖期下调lnc721可以极显著抑制MMP9表达（P<0.01），而在分化期则极显著促进MMP9的表达（P<0.01），证实了MMP9为lnc721调控牛骨骼肌卫星细胞互作的靶基因。进而下调MMP9，检测对增殖期细胞的影响，发现Ki67的mRNA水平表达极显著上调（P<0.01）,Pax7蛋白表达量显著上调（P<0.05）,EdU观察下调MMP9后的阳性细胞率也明显升高。同样检测下调MMP9之后对细胞分化期的影响，发现下调MMP9后镜下观察发现下调MMP9会抑制肌管形成，同时MyHC的mRNA和蛋白表达量极显著下降(P<0.01), MyoG蛋白表达量显著下调(P<0.05)。【结论】lnc721与MMP9相互结合。在细胞增殖期干扰lnc721极显著抑制MMP9表达，而在分化期促进MMP9的表达，且干扰MMP9可促进细胞增殖并抑制分化。证明lnc721靶向MMP9调控牛骨骼肌卫星细胞的发育。

【目的】探讨长链非编码RNA LncRNA-133a对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化过程的影响。【方法】利用测序样品3、6、9月龄胎牛及24月龄成年和牛骨骼肌肌肉组织,qRT-PCR法检测LncRNA-133a的组织时序表达谱。构建牛骨骼肌卫星细胞的体外成肌诱导分化模型,模拟牛骨骼肌的生长发育过程,qRT-PCR法检测LncRNA-133a和肌细胞分化标记因子MyoG、MHC的细胞时序表达谱。利用过表达LncRNA-133载体(pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a)或LncRNA-133a抑制物(si-LncRNA 133a)转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法检测转染效率以及各转染处理组LncRNA-133a、MyoD、MyoG及MHC基因mRNA的表达水平,Western blotting检测MHC基因的蛋白表达水平;同时,通过EdU细胞增殖检测、免疫荧光蛋白染色技术检测牛骨骼肌卫星细胞增殖阶段的细胞增殖量和分化阶段的肌管融合程度。【结果】组织表达谱分析发现LncRNA-133a在3月龄胎牛肌肉组织中表达量最高,6月龄胎牛肌肉组织中次之,9月龄胎牛及成年牛肌肉组织中表达量最低,时序表达呈下降趋势;利用成功构建的牛骨骼肌卫星细胞体外诱导分化模型,进行LncRNA-133a、MyoG、MHC的细胞时序表达谱分析,结果发现在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中(D0-D3),肌分化标记因子MyoG、MHC的表达水平逐渐升高,LncRNA-133a的表达在分化阶段呈上升趋势,且分化48 h时(D2)表达量最高;成功构建的过表达LncRNA-133a或抑制LncRNA-133a的牛骨骼肌卫星细胞模型,在增殖期(D0):与对照组相比,过表达LncRNA-133a处理组EdU增殖染色检测得到EdU阳性细胞数显著增加(P<0.01),而LncRNA-133a抑制处理组EdU阳性细胞数显著减少(P<0.01),且MHC蛋白的免疫荧光蛋白染色检测观察到融合肌管的体积占比更大;而LncRNA-133a抑制处理组MyoD、MyoG及MHC的mRNA表达水平均降低,其中MyoG显著降低(P<0.01),同时MHC蛋白融合肌管的体积占比也降低。【结论】研究证实LncRNA-133a具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖及分化的作用,为进一步挖掘LncRNA-133a调节牛骨骼肌卫星细胞增殖分化调控网络机制奠定了基础。

【目的】探讨体外培养条件下北京油鸡骨骼肌卫星细胞分离、培养及鉴定的方法,建立适于北京油鸡骨骼肌卫星细胞体外扩增的培养体系,为今后进一步研究北京油鸡骨骼肌卫星细胞提供技术平台。【方法】以15日龄的鸡胚胸肌为材料,采用联合酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,差速贴壁法纯化细胞,使用Pax7、Desmin、Myod等骨骼肌卫星细胞的特异性标志对所得细胞进行免疫荧光鉴定,随后进行成肌诱导分化,并比较了3种培养体系对骨骼肌卫星细胞增殖的影响。【结果】细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,证实所培养的细胞为北京油鸡骨骼肌卫星细胞;成肌诱导后,细胞相互融合形成多核的肌管,成肌特异性标志MHC表达呈阳性;对不同扩增培养体系比较...

【背景】目前关于褪黑素（melatonin,MLT）的研究多集中在家禽的生殖功能上，而与家禽肌肉发育相关的作用机制却鲜有研究。同时MLT与烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide, NMN)功能相似且都与昼夜节律相关，研究发现MLT与NMN的单一处理对细胞衰老的影响有限，而共同处理的效果更为显著，虽然二者对线粒体功能和骨骼肌衰老的影响也有相关报道，但在骨骼肌生长发育的作用机制方面尚无可以参考的报道。【目的】通过探究MLT与NMN参与浙东白鹅骨骼肌卫星细胞增殖的分子机制，为其在家禽生产实践中的应用提供思路。【方法】通过解剖鹅胚分离培养鹅骨骼肌卫星细胞，并对骨骼肌卫星细胞的特异性蛋白Pax7和Desmin进行免疫荧光染色以此鉴定细胞，在体外成熟培养基础上用1 ng·mL-1 MLT与1μg·mL-1 NMN分别单独或组合处理细胞24 h后，利用CCK-8检测细胞活力；为探究MLT如何调控鹅骨骼肌卫星细胞增殖的机制，通过构建MLT受体基因（MTNR1A、MTNR1B）的过表达载体，并与1 ng·mL-1 MLT共同处理细胞，采用qRT-PCR和Western blot实验技术研究过表达MTNR1A、MTNR1B是否影响MLT对增殖基因的促进作用；为了进一步探究MLT与NMN对鹅骨骼肌卫星细胞增殖相关基因的影响，采用qRT-PCR和Western blot实验技术检测骨骼肌细胞增殖相关基因的表达变化。【结果】骨骼肌卫星细胞的特异性标志蛋白Pax7和Desmin分别在细胞核和细胞质中呈绿色荧光的阳性反应，结果表明试验所用细胞为骨骼肌卫星细胞，CCK-8检测结果表示1 ng·mL-1 MLT与1μg·mL-1 NMN促进鹅骨骼肌卫星细胞活性，qRT-PCR和Western blot结果显示，与对照组相比，过表达MLT受体基因MTNR1A、MTNR1B后，增殖标志基因Pax7的mRNA和蛋白表达显著上调（P<0.05），抑制增殖的标志基因MSTN的mRNA和蛋白表达显著下调（P<0.05），抑制增殖的标志基因MSTN的mRNA和蛋白表达显著下调（P<0.05），其变化比NMN和MLT单独处理更为显著。【结论】MLT通过其受体促进骨骼肌卫星细胞增殖，NMN和MLT共同处理可以加强MLT对鹅骨骼肌卫星细胞增殖的促进作用，也为MLT和NMN在家禽实际生产中的应用提供了新思路。

【目的】卵泡抑素（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）能够调节骨骼肌肥大和脂肪沉积，可促进骨骼肌卫星细胞增殖。拟采用体外重组Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ处理增殖期的鸭骨骼肌卫星细胞，阐明ｔＧＦ－β／ｓｍａｄ信号通路在Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制。【方法】以孵化１４ ｄ的鸭胚为试验材料，采用差速贴壁的方法分离骨骼肌卫星细胞，待细胞长到７０％—８０％时，将培养基换成含有浓度分别为０、１、１０、１００ ｎＧ·ｍ ｌ－１的Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ培养基，继续培养３６ ｈ后，采用ＣＣＫ－８检测骨骼肌卫星细胞增殖情况；使用抗ｐａｘ７抗体染色，ｄａｐｉ染核，鉴定骨骼肌卫星细胞；采用ｒｅａｌ－ｔ．．．

【目的】探索胎牛骨骼肌卫星细胞分离、培养、鉴定及基因转染的方法。【方法】分别采用Ⅰ型胶原酶消化、Ⅰ型胶原酶与胰蛋白酶二步消化及链霉蛋白酶消化法对胎牛骨骼肌卫星细胞进行培养,比较了3种不同分离方法所得细胞数及其存活率的差异;利用差速贴壁法和Percoll密度梯度离心相结合的方法纯化骨骼肌卫星细胞,对纯化后的细胞进行myostatin基因RT-PCR以及结蛋白(Desmin)免疫细胞化学染色鉴定,最后通过电转染法对纯化的骨骼肌卫星细胞进行EGFP基因转染研究。【结果】3种消化培养方法中,以链霉蛋白酶消化法分离得到的胎牛骨骼肌卫星细胞数显著高于其它2种方法(P<0.05),但细胞存活率较低(P<0....

【目的】建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、纯化及鉴定的方法,并对其生物学特性进行探讨,为进一步研究猪肌肉生长发育提供良好的细胞模型。【方法】选取1日龄仔猪背最长肌为材料,无菌状态下将背最长肌剪碎为肉糜状。此后采用浓度为0.2%的Ⅰ型胶原酶消化90 min,再加入浓度为0.25%的胰蛋白酶37℃联合消化30 min。经终止消化、过滤、重悬后将分离得到的细胞置于37℃、5%CO_2细胞培养箱中培养。选用反复差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行纯化,第一次纯化选择在细胞接种2 h后,将未贴壁细胞转移至新培养皿。上清液继续培养18 h后,对卫星细胞进行第二次差速贴壁纯化。当细胞密度达70%—80%时可对细胞进行传代或冻存处理。利用细胞免疫荧光技术检测P2代卫星细胞标志基因Pax7、MyoD的蛋白表达情况,并绘制卫星细胞生长曲线。分别添加不同诱导分化液使卫星细胞定向分化为肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞,检测成肌分化标志基因MHC的免疫荧光,鉴定卫星细胞肌管形成情况;油红O染色及油红O定量鉴定卫星细胞诱导成脂分化效果;茜素红染色鉴定卫星细胞成骨分化能力,qRT-PCR检测成肌、成脂、成骨进程中关键基因的表达。【结果】通过两步酶消化和反复差速贴壁法分离纯化得到了纯度较高的卫星细胞,刚分离的细胞折光性强,贴壁后呈梭形或纺锤形,此后细胞延展并开始快速增殖。卫星细胞特异标志蛋白Pax7、MyoD细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,表明分离细胞为骨骼肌卫星细胞。骨骼肌卫星细胞增殖过程经潜伏期、生长期最终达到平台期,细胞生长曲线呈"S"型。当细胞生长至90%密度时,卫星细胞会出现自融合现象。对分离的骨骼肌卫星细胞成肌诱导分化后,可见邻近卫星细胞融合形成大量粗长肌管,多核肌管呈方向性排列,成肌标志蛋白MHC染色呈阳性。qRT-PCR结果显示标志基因MyoD、MyoG在成肌诱导分化过程中二者均呈先上升后下降趋势。经成脂诱导后细胞形态变为三角形,连续诱导发现脂滴出现并聚集成大脂滴,油红O染色可见大量红色葡萄样脂滴。油红O定量检测结果表明,成脂诱导过程中甘油三酯含量呈稳步上升趋势,各时间点均存在极显著差异(P<0.01)。qRT-PCR结果显示,PPARγ基因表达量在诱导中后期高表达;FABP4在诱导分化第6天达到最高,极显著高于其余时间点(P<0.01)。【结论】建立了基于联合酶消化和反复差速贴壁实现猪骨骼肌卫星细胞分离和纯化的方法,所得细胞增殖能力强且具有多向分化潜能,为猪骨骼肌卫星细胞作为种子细胞用于未来组织工程研究提供了技术平台。

【目的】卵泡抑素(Follistatin)能够调节骨骼肌肥大和脂肪沉积,可促进骨骼肌卫星细胞增殖。拟采用体外重组Follistatin处理增殖期的鸭骨骼肌卫星细胞,阐明TGF-β/Smad信号通路在Follistatin调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制。【方法】以孵化14 d的鸭胚为试验材料,采用差速贴壁的方法分离骨骼肌卫星细胞,待细胞长到70%—80%时,将培养基换成含有浓度分别为0、1、10、100 ng·m L-1的Follistatin培养基,继续培养36 h后,采用CCK-8检测骨骼肌卫星细胞增殖情况;使用抗pax7抗体染色,DAPI染核,鉴定骨骼肌卫星细胞;采用real-t...

为研究鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞生物学特性,取30～50日龄鲁西黄牛胚胎四肢骨骼肌,分离培养鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞。结果显示,试验成功地分离了鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞,原代培养并传代至16代,免疫细胞化学染色检测卫星细胞表面特异性标志Desmin、MyoD呈阳性表达,RT-PCR检测Desmin、c-Met、Myf5、pax7呈阳性表达;绘制生长曲线,结果说明细胞具有较强增殖能力;应用流式细胞仪对细胞进行周期分析,结果显示S期细胞所占比例为8.94%;骨骼肌卫星细胞向成肌细胞诱导10d后,免疫细胞化学染色检测成肌特异性标志骨骼肌肌球蛋白呈阳性表达;骨骼肌卫星细胞向脂肪细胞诱导7d后,油红...

【目的】旨在证明miR-222可促进家兔骨骼肌卫星细胞增殖。【方法】利用实时荧光定量(RT-qPCR)法检测miR-222在初生新西兰兔各组织中的表达量;利用targetscan、miRbase等生物信息学软件预测miR-222的靶基因;对靶基因进行KEGG通路分析和GO分析,进而预测miR-222是否参与调控骨骼肌卫星细胞增殖;体外培养的骨骼肌卫星细胞转染miR-222过表达和抑制表达载体,利用CCK-8实验和EdU染色实验检测72、96和120 h细胞的增殖情况。【结果】miR-222在各组织中差异表达,且在肝脏中的表达量最高,回肠中的表达量最低;预测得到的靶基因富集到MAPK、PI3K-AKT等多个参与骨骼肌卫星细胞增殖的重要信号通路; CCK-8实验和EdU染色鉴定发现,过表达miR-222能促进骨骼肌卫星细胞增殖,miR-222抑制表达抑制骨骼肌卫星增殖。【结论】miR-222能够促进家兔骨骼肌卫星细胞的增殖。

细胞周期蛋白M2(CNNM2)是参与体内镁离子平衡的重要候选基因,实验采用的CRISPR/Cas9系统是近几年发展起来的一类新型基因打靶技术。在斑马鱼CNNM2基因的一号外显子处选取打靶位点,构建sgRNA表达载体。随后将体外转录的sgRNA和Cas9 mRNA混合物分别以约30 pg和300 pg的剂量显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中实现对目的靶基因CNNM2的敲除。24~48 h后PCR产物回收,限制性酶切法初步检测基因打靶情况,最后进行测序分析确定突变类型。为进一步验证突变的稳定遗传性,选择了具有敲除效率的F0与野生型斑马鱼进行外交,对获得的F1进行逐一剪尾,提取DNA进行PCR和测序...

细胞周期蛋白Ｍ２（ＣＮＮＭ２）是参与体内镁离子平衡的重要候选基因，实验采用的ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ９系统是近几年发展起来的一类新型基因打靶技术。在斑马鱼ＣＮＮＭ２基因的一号外显子处选取打靶位点，构建ＳｇＲＮａ表达载体。随后将体外转录的ＳｇＲＮａ和ＣａＳ９ ＭＲＮａ混合物分别以约３０ Ｐｇ和３００ Ｐｇ的剂量显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中实现对目的靶基因ＣＮＮＭ２的敲除。２４～４８ ｈ后ＰＣＲ产物回收，限制性酶切法初步检测基因打靶情况，最后进行测序分析确定突变类型。为进一步验证突变的稳定遗传性，选择了具有敲除效率的Ｆ０与野生型斑马鱼进行外交，对获得的Ｆ１进行逐一剪尾，提取ＤＮａ进行ＰＣＲ和测序．．．

【目的】在骨骼肌生长或损伤刺激下,骨骼肌卫星细胞被激活、增殖分化形成肌管,促进骨骼肌的生长发育或修复组织创伤。FoxO1负调控骨骼肌的生成,但在骨骼肌卫星细胞分化过程中的作用未见报道。因此,笔者探索FoxO1对猪骨骼肌卫星细胞分化的影响,希望为深入研究FoxO1调控骨骼肌生长发育的作用机理奠定基础。【方法】以1—3日龄健康大白猪为材料,采用单根肌纤维法分离培养猪骨骼肌卫星细胞,接种第2天、第4天和第6天在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。在细胞分化第8天,用免疫荧光染色方法染肌管,DAPI染核,并在荧光倒置显微镜下观察拍照。待细胞汇合至70%—80%时,将培养基换成含50 nmol·L-1渥曼青...

以高邮鸭和金定鸭为研究对象,采用实时荧光定量PCR方法测定生肌调节因子MyoD1和Myf5基因在不同发育阶段鸭胚(13、15、17、19、21和23胚龄)骨骼肌成肌细胞中的表达水平,分析MyoD1和Myf5基因在鸭胚胎期骨骼肌成肌细胞中的表达模式和差异.结果表明,Myf5和MyoD1基因在胸腿肌成肌细胞中呈现不同的表达规律:胸肌成肌细胞中,Myf5基因的表达呈"低→高→低→较高"的趋势,类似反"∽"形;MyoD1基因的表达呈"低→高→低"的趋势,在金定鸭17胚龄时达到高峰后迅速下降(P0.05)...