当外源ＤＮＡ通过转基因技术导入植物细胞后，会以同源重组或非同源重组两种不同的方式整合到基因组中，进而获得相应的目标性状。外源ＤＮＡ与受体细胞序列相同或相近的位点发生重新组合，从而整合到受体细胞的染色体上称之为同源重组；当发生了ＤＮＡ双链断裂的细胞为了避免ＤＮＡ或染色体断裂而造成ＤＮＡ降解或对生命力的影响，而强行将２个ＤＮＡ断端彼此连接在一起时则为非同源重组。发生非同源重组的细胞其基因组常出现核苷酸片段的插入和／或缺失以及其他突变等多种情况，使得研究者无法得到精确控制的突变结果；而发生同源重组的细胞基因组序列通常不变，通过加入同源重组的供体ＤＮＡ，可以实现对基因组的精确修饰和改造。由于在植物中产．．．

当外源DNA通过转基因技术导入植物细胞后,会以同源重组或非同源重组两种不同的方式整合到基因组中,进而获得相应的目标性状。外源DNA与受体细胞序列相同或相近的位点发生重新组合,从而整合到受体细胞的染色体上称之为同源重组;当发生了DNA双链断裂的细胞为了避免DNA或染色体断裂而造成DNA降解或对生命力的影响,而强行将2个DNA断端彼此连接在一起时则为非同源重组。发生非同源重组的细胞其基因组常出现核苷酸片段的插入和/或缺失以及其他突变等多种情况,使得研究者无法得到精确控制的突变结果;而发生同源重组的细胞基因组序列通常不变,通过加入同源重组的供体DNA,可以实现对基因组的精确修饰和改造。由于在植物中产...

CRISPR/Cas9系统作为新一代基因组编辑技术,一经问世就受到广泛关注。CRISPR/Cas9系统具有对特定基因位点进行精确修饰(包括敲除、插入、替换等)的强大功能,同时具有操作简单、效率高、适应性广等技术优势,目前已在微生物、植物、动物以及人类基因治疗等整个生命科学领域得到应用。本文简要介绍了CRISPR/Cas9技术的发展历程、作用机理、技术优势、功能及应用领域,总结该技术在植物领域的基因组定向编辑中的研究进展。并提出了这项技术在草类植物基因功能分析、基因代谢调控途径与遗传改良等方面的应用前景,为

将CRISPR/Cas9系统与毛根转化相结合,在豆科植物百脉根和大豆中对结瘤因子受体激酶基因NFR1进行多靶点敲除,旨在快速、便捷获得目的基因突变体。结果表明:在百脉根和大豆中均获得了目的基因敲除的突变体;其中,百脉根LjNFR1基因中靶位点1处的敲除效率为58.3%,在靶位点2处的敲除效率为0;大豆GmNFR1靶位点1处的敲除效率为33.3%,靶位点2处的敲除效率为41.7%。进一步测序分析发现,CRISPR/Cas9系统可同时敲除大豆基因组上编码NFR1的2个同源基因(GmNFR1和GmNFR1b),

【目的】易落粒既不利于稻谷收获,也不适宜于水稻机械化生产。利用现阶段前沿的分子育种手段——CRISPR/Cas9技术对水稻落粒性主效基因qSH1进行定点编辑,并调查分析易落粒性状的改良效果,为创制稳产和适合机械化生产的水稻新种质奠定材料基础和探索新途径。【方法】以qSH1为靶标基因,根据CRISPR/Cas9技术原理设计靶标位点。将所设计的靶点序列在水稻参考基因组中比对分析以排除非特异性靶位点,最终筛选出qSH1-T1和qSH1-T5靶标位点。化学合成靶位点寡核苷酸序列,退火后分别与pYLg RNA-U3、pYLg RNA-U6a载体连接构建U3-qSH1T5-g RNA、U6a-qSH1T1-g RNA表达盒,最后将2个g RNA表达盒同时连接至pYLCRISPR/Cas9表达载体中,构建pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51表达载体。利用农杆菌介导转化易落粒的籼稻品种HR1128,以潮霉素抗性为筛选标记筛选获得T0代转基因阳性植株。利用靶位点扩增测序法判断T0代转基因植株在预期靶标位点是否发生突变,并进一步分析突变类型及基因型。将靶点序列在水稻参考基因组中比对,选择与靶点序列匹配度大于或等于15 bp且3′端具有NGG的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估。利用潮霉素基因及靶点检测进一步筛选无T-DNA成分的qsh1突变植株并进一步构建qsh1突变系,并分析qsh1突变系的落粒性、qSH1的表达量及预测编码氨基酸序列。【结果】pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51载体成功地实现了对qSH1靶标位点的定点编辑。在T0代转基因阳性植株中获得7个突变单株,其中qSH1-T1和qSH1-T5靶点的突变频率分别为54.55%和63.64%,突变基因型包括纯合突变、杂合突变、双等位突变和嵌合突变,突变类型包括碱基插入、碱基缺失及碱基突变。通过对T1代植株进行潮霉素基因筛选、靶位点扩增测序,结果表明,在T1代植株中Cas9载体骨架和qSH1突变位点都发生了分离,获得2种不含T-DNA成分的qsh1纯合突变株,并以此构建2个T2代qsh1纯合突变系群体(17SZ01和17SZ02)。对46株转基因阳性植株进行脱靶效应分析,发现3个潜在脱靶位点均未发生突变,表明所设计的靶标位点具有较高的特异性。通过落粒性测定分析表明,与野生型对照相比,2个qsh1纯合突变系的落粒性显著降低。进一步分析发现,2个突变系氨基酸翻译均发生改变并提前终止,同时17SZ01突变系qSH1的表达量显著降低。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对水稻基因组进行定点编辑定向改良水稻品种落粒性,是一条高效、安全的分子改良育种策略。

基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术是一种新兴的分子修饰工具,可实现基因组特定位点碱基的缺失、插入或替换,造成基因功能丧失,现已广泛应用于基因功能的研究。为深入探讨甘蓝型油菜中Bn SVP的生物学功能,以中双11号基因组(甘蓝型油菜参考基因组,v4.1)中的4个Bn SVP为靶标基因,并针对不同染色体上的Bn SVP基因,应用CRISPR-P 2.0软件共设计了12条特异sg RNA种子序列,以实现4个Bn SVP同源基因的全部或部分敲除;以p YLCRISPR-Cas9P35S-H为基本载体,以At U3b或At U3d为sg RNA转录启动子,采用Golden gate cloning技术分别组装构建了6个双靶点CRISPR/Cas9植物表达载体。测序结果表明,6个CRISPR/Cas9植物表达载体各sg RNA表达盒DNA序列正确,双靶点组装顺序无误。研究结果为进一步原生质体瞬时表达和农杆菌介导的油菜遗传转化奠定了基础,同时也为应用CRISPR/Cas9基因组编辑系统研究植物多拷贝同源基因的功能提供参考。

ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ９系统是近年发展起来的、由导向ＲＮａ介导的基因组定向编辑技术。总结了ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ９基因组定向编辑技术的发展历程，并综述了其在作物遗传育种研究中的多方面应用。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ系统是存在于大多数细菌与所有古生菌中的一种后天免疫系统，以消灭外来质体或者噬菌体。根据ＣａＳ蛋白组分及氨基酸序列不同，已发现的ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ系统可以分为３种不同类型，Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中，Ⅱ型是以ＣａＳ９蛋白及导向ＲＮａ为核心组份，组成较为简单，是目前经过改造用于开发基因组定向编辑技术的主要类型。自ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ９技术体系首先在人类与动物细胞系中建立后，经过改造的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ．．．

利用chopchop网站对大鼠Inhba基因的第二外显子设计sgRNA位点，通过合成sgRNA寡核苷酸、酶切连接构建到px330载体，再转染px330–Inhba–sgRNA载体到大鼠L6细胞，通过T7E1酶切、T载体克隆测序来验证sgRNA编辑Inhba基因的效率。结果表明：转染pX330–Inbha–sgRNA载体后，Inhba基因的编辑区域的PCR产物能被T7E1酶切割预期条带；T载体克隆测序显示，随机选取的20个单克隆中有5个克隆在预期切割位点附近出现不同长度的碱基缺失，估测编辑效率为25%。可见，本研究设计的sgRNA能够有效的利用CRISPR/Cas9系统对Inhba基因进行编辑。

利用chopchop网站对大鼠Inhba基因的第二外显子设计sgRNA位点，通过合成sgRNA寡核苷酸、酶切连接构建到px330载体，再转染px330–Inhba–sgRNA载体到大鼠L6细胞，通过T7E1酶切、T载体克隆测序来验证sgRNA编辑Inhba基因的效率。结果表明：转染pX330–Inbha–sgRNA载体后，Inhba基因的编辑区域的PCR产物能被T7E1酶切割预期条带；T载体克隆测序显示，随机选取的20个单克隆中有5个克隆在预期切割位点附近出现不同长度的碱基缺失，估测编辑效率为25%。可见，本研究设计的sgRNA能够有效的利用CRISPR/Cas9系统对Inhba基因进行编辑。

利用chopchop网站对大鼠Inhba基因的第二外显子设计sg RNA位点,通过合成sg RNA寡核苷酸、酶切连接构建到px330载体,再转染px330–Inhba–sg RNA载体到大鼠L6细胞,通过T7E1酶切、T载体克隆测序来验证sg RNA编辑Inhba基因的效率。结果表明:转染p X330–Inbha–sg RNA载体后,Inhba基因的编辑区域的PCR产物能被T7E1酶切割预期条带;T载体克隆测序显示,随机选取的20个单克隆中有5个克隆在预期切割位点附近出现不同长度的碱基缺失,估测编辑效率为25%。可见,本研究设计的sg RNA能够有效利用CRISPR/Cas9系统对Inhba基因进行编辑。

利用chopchop网站对大鼠Inhba基因的第二外显子设计sg RNA位点,通过合成sg RNA寡核苷酸、酶切连接构建到px330载体,再转染px330–Inhba–sg RNA载体到大鼠L6细胞,通过T7E1酶切、T载体克隆测序来验证sg RNA编辑Inhba基因的效率。结果表明:转染p X330–Inbha–sg RNA载体后,Inhba基因的编辑区域的PCR产物能被T7E1酶切割预期条带;T载体克隆测序显示,随机选取的20个单克隆中有5个克隆在预期切割位点附近出现不同长度的碱基缺失,估测编辑效率为25%。可见,本研究设计的sg RNA能够有效利用CRISPR/Cas9系统对Inhba基因进行编辑。

日本结缕草(Zoysia japonica)是一种常见的具有众多优良性状的暖季型草种,秋冬季节在我国北方地区会较早出现叶片脱绿现象,在一定程度上限制了日本结缕草在北方的大面积使用。ZjSGR是从结缕草中分离出来的一种衰老诱导基因,负调控叶片滞绿性状。本研究利用CRISPR/Cas9系统,通过基因枪介导的遗传转化方法实现对日本结缕草ZjSGR基因的编辑,经测序验证获得1株单碱基缺失突变植株。突变植株叶片深绿,在正常生长温度(28～30℃)条件下,和对照相比,叶绿素含量更高(P <0.05)。本研究为进一步阐述ZjSGR基因在日本结缕草滞绿性状调控中的作用机理提供了基础研究材料,也为培育日本结缕草滞绿品种育种工作奠定了基础。

结合实验教学中实际经验和课程需求,利用学科优势,依托前沿科研成果,设计并建设了拟南芥CRISPR/Cas9基因编辑虚拟仿真实验系统,将虚拟仿真技术应用于遗传学实验教学。通过该实验系统,学生不仅可以自主学习并掌握基因编辑的相关理论知识和全过程实验操作,有效激发学习兴趣,还可以通过反复练习并配合实体实验教学,切实提高实践能力。该实验开拓了遗传学虚拟仿真实验新资源和实验教学新途径。

油菜是世界第二大油料作物，同时也是我国最主要的食用植物油来源。长期以来，油菜育种工作者尝试通过传统育种策略培育良种。然而，甘蓝型油菜是种间杂交后双二倍进化而来的异源四倍体物种，其基因组中存在较多基因冗余现象。因此，通过人工杂交选择、随机诱变等传统遗传方法改良性状效率非常低。近年来，CRISPR/Cas9技术以其高效、简便的独特优势，已广泛应用于多倍体油菜的基因功能研究和定向遗传改良。为了能够快速高效地对甘蓝型油菜进行种质资源创新和遗传改良，将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于甘蓝型油菜恰逢其时。本文综述了目前CRISPR/Cas9系统应用于油菜基因功能研究和遗传改良的研究进展，涉及油菜产量、含油量和脂肪酸组成、生物和非生物胁迫耐受性等重要农艺性状，并探讨了油菜基因编辑存在的局限性以及未来发展的方向。

系统发育研究是进化生物中的基本问题，也是其他众多生物学分支学科的基础问题，其核心在于研究不同生物类群间的亲缘关系与进化命运。利用分子数据研究生物之间的进化关系是系统发育研究的重要手段。随着测序技术的提升和测序成本的持续下降，系统发育研究由早期基于单基因或联合少数片段逐步发展到现阶段利用大规模基因组数据对个体、群体、物种以及更高水平的进化关系进行探讨。讨论了目前植物体内的3套基因组(叶绿体基因组、线粒体基因组与核基因组)在系统发育研究中的代表性成果，总结了植物不同基因组的特征及其在系统发育研究中的优势与局限，探讨了系统发育树构建的主要方法，并对未来研究进行了展望。目前，植物体内的3套基因组适用于不同阶元和类群的系统发育研究，不同基因组之间的遗传特性差异使其在系统发育研究中具备不同的优势和应用：(1)叶绿体基因组结构相对简单，序列保守，不易重组，单亲遗传，是广泛应用于系统发育学和进化生物学等研究领域的理想分子数据资源；(2)植物线粒体基因组序列进化速率较慢，目前仅适用于早期植物和大尺度水平的系统发育研究；(3)核基因组为双亲遗传，可综合揭示双亲谱系及系统网状进化关系，在系统发育研究中具有巨大的应用潜力。不同建树方法适用于不同特征的数据集，在建树过程中应采用合理的方法避免长枝吸引和不完全谱系分选带来的影响。未来核基因组将成为系统发育研究的主流方向，其双亲遗传特性能够为物种形成过程中的杂交和基因组渗入等事件提供充分的见解。随着越来越多的类群系统位置被确定，物种形成和进化过程中的杂交、回交等双亲遗传，以及核质互作、多倍化、功能适应和趋同进化等问题将会成为系统发育研究的重点。表1参78