【目的】探明COL1A1（Collagen type I alpha 1 chain，I型胶原蛋白α1链）和COL1A2（Collagen type I alpha 2 chain，I型胶原蛋白α2链）基因在梅花鹿不同组织中的表达谱，解析其对梅花鹿组织发育的影响，为影响梅花鹿重要经济性状的候选基因筛选提供依据。【方法】采用RT-qPCR方法检测COL1A1和COL1A2基因在雄性梅花鹿心脏、肝脏和脾脏等16个组织器官中的表达水平；结合NetPhos 3.1、Motif Search和ProtParam等系列软件预测分析COL1A1和COL1A2基因的生物信息及其在梅花鹿不同组织中的表达谱，并在此基础上构建COL1A1和COL1A2氨基酸序列的系统发育进化树。【结果】COL1A1和COL1A2基因CDS区分别编码1 463和1 364个氨基酸，理论PI分别为5.60和9.19，COL1A1和COL1A2均是一种具有信号肽和磷酸化位点的亲水性稳定蛋白质；二者蛋白二级及三级结构均以无规则卷曲构成；与其他动物相比，鹿COL1A1和COL1A2基因均与反刍动物山羊、绵羊和牛的同源性最高，其中，鹿COL1A1基因与山羊、牛、绵羊的同源性分别为99.5%、99.5%和99.2%，鹿COL1A2基因与牛、绵羊、山羊的同源性分别为99.1%、99.0%和98.9%，亲缘关系最近。RT-qPCR结果显示：COL1A1和COL1A2基因在梅花鹿不同组织中均有表达，其中，COL1A1基因在心脏、背最长肌和腿肌中的表达较高，显著高于其他组织，COL1A2基因在心脏、肝脏、肾脏和瓣胃中的表达较高，均显著高于其他组织；此外，COL1A1在肌肉组织中的表达较高，COL1A2较低；二者在其余组织中的表达具有一高一低，相互协同的作用趋势。【结论】COL1A1和COL1A2可能通过相互协同共同维持组织结构及组织发育，相关结果为后续深入研究COL1A1和COL1A2影响梅花鹿生长发育奠定基础。

为探究COL1A1基因表达的Ⅰ型胶原蛋白α1链在组成生物体结构和骨发育中的重要作用，以梅花鹿茸生长过程的小鞍子（前期）、二杠（中期）和三杈茸（后期）3个典型时期鹿茸顶端组织及其茸皮、间充质、前软骨和软骨4个组织层为试验材料，采用亚硫酸氢盐测序法（BSP技术），从时空角度研究鹿茸生长过程中顶端不同组织COL1A1基因启动子区DNA甲基化模式及其相互间DNA甲基化差异。结果显示：1)COL1A1基因在前、中、后期的茸皮组织中的甲基化率分别为（9.73±0.92）%、（7.60±0.69）%和（3.73±0.23）%；间充质组织中的甲基化率分别为（3.20±0.40）%、（1.33±0.23）%和（1.60±0.69）%；前软骨组织中的甲基化率分别为（4.67±0.83）%、（2.53±0.46）%和（2.67±0.23）%；软骨组织中的甲基化率分别为（5.60±0.40）%、（2.80±0.40）%和（2.27±0.61）%。2)COL1A1基因启动子区的甲基化区域共有25个CG位点，在17个CG位点上均发生了不同程度的甲基化。3）对COL1A1基因启动子区DNA甲基化差异分析发现，相同时期中，茸皮组织甲基化率最高，间充质组织甲基化率最低；相同组织中，中期比前期显著下调；CG位点的比较中，前期与中期的CG位点差异程度较大。综上，COL1A1基因在快速生长期，以及在间充质组织、前软骨组织、软骨组织中对鹿茸生长具有促进作用。在DNA甲基化水平上探究梅花鹿鹿茸不同组织的时空表观遗传差异，为鹿茸快速生长与骨化机制的研究，以及哺乳动物组织再生和器官修复等领域的研究提供了科学参考。

【目的】克隆梅花鹿(Cervus nippon)胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)的成熟肽基因,并对其进行原核表达及纯化,以获得具有生物学活性的蛋白,为研究IGF-1在梅花鹿鹿茸生长发育中的调控作用及机理提供参考。【方法】以GenBank中的梅花鹿IGF-1基因序列(登录号:HQ890468)设计1对引物,以构建的梅花鹿pMD-18T-IGF-1重组质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽的基因序列,构建重组质粒pMD-IGF-1,将其插入pET-32a表达载体后,构建pET-32a-IGF-1质粒,鉴定后,将pET-32a-IGF-1转入Ros...

为分析梅花鹿KGF基因的生物学特性及其在鹿茸生长不同阶段顶端茸皮组织的表达差异，以雄性梅花鹿茸皮组织为试验材料克隆梅花鹿KGF基因，并采用荧光定量PCR技术对KGF基因在梅花鹿鹿茸顶端不同生长阶段的茸皮组织中的表达量进行差异分析。结果表明：1）成功克隆获得梅花鹿KGF基因的完整编码区，全长为585bp，共编码194个氨基酸；KGF基因编码的蛋白质是具有跨膜结构的不稳定的亲水蛋白，其相对分子质量为22 489.17，理论等电点pI为9.35；二级结构以无规则卷曲为主；2）通过Blastp功能比对显示梅花鹿KGF基因与马鹿、白尾鹿、牛、野牛、山羊的相似性均在99%以上；3）荧光定量PCR结果显示，KGF基因的表达量在梅花鹿鹿茸前期与中期、前期与后期的顶端茸皮组织中差异显著（P0.05）。综上，本研究发现梅花鹿KGF基因在进化中的保守性较高，对鹿茸的生长发育与组织修复有重要作用，其在不同时期茸皮组织中的相对表达量存在差异。本研究为进一步探索鹿茸生长的分子机理奠定基础，为哺乳动物的组织创伤修复提供参考。

研究十型胶原蛋白(Collagen type Ⅹ,Col Ⅹ),在软骨内成骨过程中所起的作用。本研究针对梅花鹿Col Ⅹ基因设计筛选2条高分RNAi靶序列,在T4 DNA连接酶的作用下分别与慢病毒载体质粒plvthm连接,形成重组质粒S2-plvthm/S3-plvthm;PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。用Lipofectamine 2000介导S2-plvthm/S3-plvthm,pCMVdr8.91,pMD2G三质粒共转染293T细胞。结果显示:转染24 h后,观察到表达荧光蛋白的293T细胞。收集培养液后进行1000g离心5 min,所得上清液含有重组慢病毒的组分。S2-plvthm/S...

ＳＯＣ１／ＴＭ３（ＳｕｐｐｒｅＳＳＯｒ Ｏｆ ＯｖｅｒｅｘｐｒｅＳＳｉＯｎ Ｏｆ ＣＯｎＳＴａｎＳ １／ＴＯＭａＴＯ ＭａＤＳ－ｂＯｘ ｇｅｎｅ ３）是ＭａＤＳ－ｂＯｘ家族一员，它能够整合多条开花途径的开花信号，调节植物由营养生长向生殖生长的转变。为了解梅花成花转变过程的分子机理，采用ｒＴ－ｐＣｒ的方法从梅花长蕊绿萼中克隆到３个ＳＯＣ１的同源基因，分别命名为ｐＭ ＳＯＣ１－１、ｐＭ ＳＯＣ１－２和ｐＭＳＯＣ１－３，并采用荧光定量ｐＣｒ对３个基因的表达模式进行了分析。序列分析表明，３个基因的编码区长度分别为６４５ ｂｐ（ｐＭ ＳＯＣ１－１）、６５４ ｂｐ（ｐＭ ＳＯＣ１－２）和６６０ ｂｐ（ｐＭ．．．

【目的】体外真核表达梅花鹿(Cervus nippon)激活素A重组蛋白并测定其生物活性,为进一步明确激活素A在梅花鹿卵母细胞体外成熟过程中的生理学功能提供基础。【方法】利用RT-PCR技术克隆梅花鹿激活素βA (ActivinβA, ACTBA)亚基基因的cDNA全长序列,同时利用生物信息学对梅花鹿激活素βA的基因特征进行分析。在NCBI数据库下载其他物种激活素βA同源序列,利用Clustalx和MEGA 4软件进行同源比对并构建进化树。构建pcDNA4/ACTBA重组质粒并转染至CHO细胞内,进行目的蛋白的体外表达。采用免疫荧光及Western blot技术对目的蛋白表达情况进行检测,并通过Ni-NTA亲和层析柱对蛋白产物进行纯化。采用Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中的SMAD2和SMAD3的磷酸化水平。最后采用荧光定量PCR及Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中类固醇激素合成相关酶的表达量。【结果】克隆得到的梅花鹿ACTBA亚基基因含有1 278 bp的碱基,编码426个氨基酸。同源性比较发现梅花鹿ACTBA基因与牛的ACTBA基因同源性最高达98.4%同源。进化分析表明该基因与同为偶蹄目动物的反刍兽牛和山羊亲缘关系最为接近。经酶切、PCR和测序方法鉴定,成功构建真核表达质粒pcDNA4/ACTBA。免疫荧光显示该质粒在CHO细胞中主要定位在细胞质。Western blot结果显示激活素A的前体蛋白分子量约为58 kD左右。镍亲和层析纯化后的激活素A重组蛋白显著增加SMAD2和SMAD3的磷酸化,表明激活素A可以激活SMAD信号通路。同时成熟的激活素A重组蛋白可以诱导猪颗粒细胞芳香化酶(Aromatase)蛋白表达量上调,类固醇生成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)表达量下调,FSH受体基因表达量升高,LH受体基因表达量降低,但胆固醇侧链裂解酶(Cholesterolside-chaincleavageenzyme,CYP11A1orP450scc)及3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-Hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)基因表达量不变。结果表明梅花鹿激活素A重组蛋白可以增强FSH对颗粒细胞的生物学作用,也可以减弱LH对颗粒细胞的生物学作用。【结论】成功构建了激活素A蛋白的真核表达载体,并获得了较高纯度的、具有生物学活性的梅花鹿激活素A重组蛋白,为下一步激活素A蛋白的生物学功能和生理学机制研究奠定了基础。

以花鲈(Lateolabrax macularus) 1～214 dph (day post hatching)的仔稚鱼、幼鱼以及 18 月龄的雌鱼和雄鱼为研究对象,研究了花鲈早期性腺发生、发育和分化情况;分析了性腺分化过程中性别相关基因(cypllb和cyp19ala)的表达及与性别之间的关系。结果显示,在30 dph [全长为(1.28±0.10) cm],首次在中肾管前端的腹腔膜周围观察到原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs),说明30 dph前是花鲈胚后PGCs迁移至生殖嵴的关键时期;在55 dph [全长为(2.45±0.19) cm],观察到一对呈对称分布的原始性腺已经形成,说明花鲈幼鱼的原始性腺在30～55 dph (全长为1.28～2.45 cm)之间发生;55～180 dph时(全长为2.45～12.28 cm),原始性腺不断发育变大,并且一直处于未分化状态;180 dph后性腺开始分化;在195 dph [全长(14.54±1.54) cm]观察到精巢开始分化,卵巢于205 dph[全长为(15.86±0.94) cm]开始分化,且性腺的解剖学分化要早于细胞学分化;18月龄的花鲈幼鱼性腺发育到Ⅱ期。性别分化相关基因cyp19ala在花鲈卵巢中的表达量高于同期精巢,说明其在卵巢的分化及维持中发挥更关键的作用,而cypllb在18月龄幼鱼Ⅱ期精巢中的表达量显著高于同时期的卵巢及Ⅰ期精巢,说明其主要在精巢的分化及维持中扮演重要角色。本研究结果不仅可以丰富花鲈的繁殖生理学资料,也为其性别调控技术的研究提供了科学依据。

为探讨二脂酰甘油酰基转移酶1和2基因(DGAT1和DGAT2)发育性表达特点及其与背膘厚的关系,采用137头肉用中国西门塔尔牛,屠宰并采集组织样品,根据胴体背膘厚度分成高、低2组,每组各选择15个个体,利用荧光定量PCR技术,对DGAT1和DGAT2基因在组织中的表达特征及其在不同个体背膘组织中的表达水平进行分析。研究发现,在睾丸、肾脏、肋间肉、心脏、胰脏、背膘、肩肉、肝脏、网脂、肠脂、脾脏、肺、眼肉和淋巴等多种组织中均有不同程度的表达,DGAT1和DGAT2在不同组之间的表达差异显著(P<0.05),且与背膘厚度呈显著相关(P<0.05)。结果表明,DGAT1和DGAT2与肉牛背膘厚度显著相...

为研究梅花鹿Thymosin beta 10基因(Tβ10)在鹿茸快速生长过程中的作用,利用Gateway技术构建梅花鹿Tβ10基因的原核表达载体—pDEST17-Tβ10并诱导表达,对融合蛋白进行功能检测及多克隆抗体制备。结果表明:1)获得了190bp Tβ10基因开放阅读框序列,并获得重组表达载体pDEST17-Tβ10。2)pDEST17-Tβ10在宿主BL21-SI中诱导表达条件为0.3mol/L NaCL诱导2h,获得产物的最终浓度为0.50mg/mL。3)制备的Tβ10蛋白多克隆抗体血清效价在105之上,该抗体可以特异性结合天然和原核表达的Tβ10蛋白。4)离体检测发现,Tβ10融合蛋白一方面可以促进人脐静脉内皮细胞增殖,另一方面可以抑制鹿茸前成软骨区细胞的增殖。综上所述,本研究获得了具有生物活性的Tβ10融合蛋白,并制备了高度特异性的梅花鹿Tβ10蛋白多克隆抗体,为深入研究Tβ10基因的生物学功能奠定了基础。

[目的]Halloween家族基因参与合成蜕皮激素，调控昆虫发育、繁殖等重要生命过程。二化螟(Chilo suppressalis)是水稻的重要害虫，明确二化螟Halloween家族基因完整序列及表达谱特征，对后续开展二化螟生长发育等调控机制研究具有重要作用。[方法]利用反转录PCR(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆二化螟Halloween家族基因成员Cyp302a1和Cyp315a1的完整转录本序列；通过多重比对分析序列保守结构特征；利用MEGA 7.0软件构建了分子系统进化树；利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析基因的时空表达谱。[结果]克隆获得二化螟Halloween家族2个基因CsCyp302a1和CsCyp315a1的全长cDNA序列。各基因均含有5个序列保守结构域：WxxxR(Helix-C)、GxE/DTT/S(Helix-I)、ExxR(Helix-K)、PxxFxPE/DRF(PERF motif)和PFxxGxRxCxG/A(heme-binding domain),并且与各自的基因家族成员聚为一支。各基因在不同发育时期和不同组织内的表达水平存在差异，其表达模式在不同基因间也存在差异。二化螟Cyp307a1相对表达量最高，Cyp315a1相对表达量最低。Cyp307a1在头部表达量高；Cyp306a1在中肠表达量高；Cyp302a1和Cyp315a1在头部和表皮中表达量高；Cyp314a1在脂肪体和表皮中表达量高。[结论]明确了二化螟Halloween家族2个基因序列特征和全部5个主要基因的时空表达谱特征。

【目的】Halloween家族基因参与合成蜕皮激素，调控昆虫发育、繁殖等重要生命过程。二化螟Chilo suppressalis是水稻上的重要害虫，明确二化螟Halloween家族基因完整序列及表达谱特征，对后续开展二化螟生长发育等调控机制研究具有重要作用。【方法】利用反转录PCR（RT-PCR）和快速扩增cDNA末端（RACE）技术克隆二化螟Halloween家族基因成员Cyp302a1和Cyp315a1的完整转录本序列；通过多重比对分析序列保守结构特征；利用MEGA软件构建了分子系统进化树；利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析基因的时空表达谱。【结果】克隆获得二化螟Halloween家族2个基因CsCyp302a1和CsCyp315a1的全长cDNA序列。各基因均含有各自的5个序列保守结构域：WxxxR（Helix-C）、GxE/DTT/S（Helix-I）、ExxR（Helix-K）、PxxFxPE/DRF（PERF motif）和PFxxGxRxCxG/A（heme-binding domain），并且与各自的基因家族成员聚为一支。各基因在不同发育时期和不同组织内的表达水平存在差异，其表达模式在不同基因间也存在差异。二化螟Cyp307a1相对表达量最高，Cyp315a1相对表达量最低。Cyp307a1在头部表达量高；Cyp306a1在中肠表达量高；Cyp302a1和Cyp315a1在头部和表皮中表达量高；Cyp314a1在脂肪体和表皮中表达量高。【结论】明确了二化螟Halloween家族2个基因序列特征和全部5个主要基因的时空表达谱特征。

【目的】研究角蛋白关联蛋白(keratin-associated proteins,KAPs)编码基因的遗传变异对绒毛性状的影响,以丰富绵羊功能基因组学并开发基因标记。【方法】采用PCR-SSCP和DNA测序技术,检测KAP20-1编码基因(KRTAP20-1)在甘肃高山细毛羊(细毛羊)、青海半细毛羊(半细毛羊)和藏绵羊(粗毛羊)3个群体中的变异情况;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,检测KRTAP20-1基因在甘肃高山细毛羊、小尾寒羊(粗毛羊)成年母羊和羔羊不同组织中的表达情况。【结果】3个绵羊群体KRTAP20-1基因共检测到4个SNPs,其中3个为非同义突变导致氨基酸的改变(P.Gly10Ser、P.Tyr29Phe和P.Ser61Gly),1个为同义突变。等位基因A在3个绵羊群体中均为优势等位基因,其余3个等位基因在不同绵羊群体中分布差异较大。甘肃高山细毛羊KRTAP20-1基因的遗传杂合度、有效等位基因数和多态信息含量均高于其他2个群体。KRTAP20-1基因只在绵羊皮肤中表达,在其他组织中均无表达;在小尾寒羊和甘肃高山细毛羊2个群体中,羔羊皮肤组织中KRTAP20-1表达量均高于母羊,且在小尾寒羊皮肤组织中的表达量高于同期甘肃高山细毛羊,即表现出明显的群体差异性和时空差异性。【结论】绵羊KRTAP20-1基因在不同用途毛用绵羊中的等位基因分布差异及组织表达的种群特异性和时空特异性提示,该基因对羊毛相关性状的形成和表型均有影响。

为探讨草鱼(Ctenopharyngodon idella)性腺发生、性别分化及发育规律，本研究对1、2、3、4、5、6、12、24、36和48月龄草鱼性腺组织结构以及性别特征基因cyp19a1a和amh的表达差异进行了分析。组织切片结果显示，2月龄时，首次在生殖嵴中观察到原始生殖细胞，标志原始性腺形成。3月龄时，雌性草鱼性腺中观察到卵巢腔和卵巢小叶。4月龄时，观察到卵原细胞，表明其在3月龄时出现解剖学分化，4月龄时出现细胞学分化。4月龄雄性草鱼在性腺中观察到输精导管，5月龄时观察到精原细胞，表明其在4月龄出现解剖学分化，5月龄出现细胞学分化。12、24、36和48月龄草鱼卵巢分别处于发育的第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期，精巢则分别为发育的第Ⅱ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期。荧光定量结果显示，雌性特征基因cyp19a1a在卵巢中的表达量总体呈先上升后下降再上升的趋势，2月龄时显著上调(P<0.05)，3、6和48月龄时处于峰值。雄性特征基因amh在精巢中表达量总体呈先上升后下降的趋势。2月龄时显著上调(P<0.05)，5月龄时达到峰值。综上，草鱼性腺发育启动时间约为2月龄，雌雄性腺分化时间分别约为3月龄和4月龄，至4龄时雌雄性腺发育成熟。本研究结果丰富了草鱼的繁殖生理学资料，也为其性别调控技术研究奠定了基础。

为探讨草鱼(Ctenopharyngodon idella)性腺发生、性别分化及发育规律，本研究对1、2、3、4、5、6、12、24、36和48月龄草鱼性腺组织结构以及性别特征基因cyp19a1a和amh的表达差异进行了分析。组织切片结果显示，2月龄时，首次在生殖嵴中观察到原始生殖细胞，标志原始性腺形成。3月龄时，雌性草鱼性腺中观察到卵巢腔和卵巢小叶。4月龄时，观察到卵原细胞，表明其在3月龄时出现解剖学分化，4月龄时出现细胞学分化。4月龄雄性草鱼在性腺中观察到输精导管，5月龄时观察到精原细胞，表明其在4月龄出现解剖学分化，5月龄出现细胞学分化。12、24、36和48月龄草鱼卵巢分别处于发育的第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期，精巢则分别为发育的第Ⅱ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期。荧光定量结果显示，雌性特征基因cyp19a1a在卵巢中的表达量总体呈先上升后下降再上升的趋势，2月龄时显著上调(P<0.05)，3、6和48月龄时处于峰值。雄性特征基因amh在精巢中表达量总体呈先上升后下降的趋势。2月龄时显著上调(P<0.05)，5月龄时达到峰值。综上，草鱼性腺发育启动时间约为2月龄，雌雄性腺分化时间分别约为3月龄和4月龄，至4龄时雌雄性腺发育成熟。本研究结果丰富了草鱼的繁殖生理学资料，也为其性别调控技术研究奠定了基础。