【目的】茉莉酰氨基酸结合物合成酶(jasmonoyl amino acid conjugate synthase,JAR1)可以催化茉莉酸(jasmonic acid,JA)形成茉莉酸的活性形式茉莉酸异亮氨基酸复合体(jasmonic acid-isoleucine,JA-Ile)，从而激活JA信号途径。JA信号途径在介导植物盐胁迫的响应中发挥重要作用，因此，探究AtJAR1在植物耐盐性中的功能对于研究JA信号途径影响植物耐盐性的机制具有重要作用。【方法】运用CRISPR/Cas9基因编辑技术，创建了2个不同的拟南芥Arabidopsis thaliana AtJAR1基因突变体，并对这2个突变体进行地上部生物量的统计分析和JA信号标记基因的表达分析，以确定AtJAR1基因功能缺失。之后，观察分析不同浓度氯化钠和脱落酸(ABA)处理对jar1突变体的种子萌发和幼苗建成的影响，明确AtJAR1基因对拟南芥耐盐性的影响。最后，通过比较分析盐处理前后野生型和突变体的钾离子(K~+)和钠离子(Na~+)质量摩尔浓度，以及高亲和力K~+转运蛋白基因AtHAK5的表达变化情况，初步探究AtJAR1基因在拟南芥耐盐性中的功能。【结果】JA信号标记基因AtVSP1和AtVSP2的表达量大幅下调，表明AtJAR1基因功能丧失。与点突变产生的jar1#1突变体不同的是，这2个突变体表现为前3周生长加快，之后逐渐减缓并出现叶片萎蔫的表型。同时，AtJAR1突变可以缓解盐胁迫和ABA对种子萌发和根系生长产生的抑制作用。此外，盐胁迫下AtJAR1突变可以促进AtHAK5的表达和根系对K~+的吸收转运。【结论】JA信号途径可能通过与ABA交互作用影响AtHAK5的表达量，以调节植物根系对K~+的吸收转运，进而改变细胞内K~+/Na~+平衡，最终影响植物耐盐性。图8表2参52

【目的】从野生型拟南芥中克隆抗寒基因ICE1,通过农杆菌介导法将ICE1基因转到烟草中,对其功能进行研究。【方法】以三叶一心期拟南芥幼苗为材料,提取其总RNA,通过RT-PCR扩增得到ICE1基因的完整开放阅读框序列;构建以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3301-ICE1,通过农杆菌介导法转入到烟草中,对阳性植株进行PCR检测和生理生化指标测定,并对ICE1基因在转基因烟草植株中的表达特征进行分析。【结果】成功克隆了拟南芥抗寒基因ICE1,其完整开放阅读框长1 485bp。系统进

EPF/EPFL基因家族成员编码一类富含半胱氨酸的分泌型小肽，本研究通过实时荧光定量PCR检测、核盘菌接种和二氨基联苯胺(DAB)染色分析11个EPF/EPFL基因在拟南芥对核盘菌防御反应中的作用.荧光定量PCR分析显示，接种核盘菌后，EPFL1、EPFL2、EPFL3、EPFL4、EPFL5、EPFL6和EPFL9的表达水平至少在一个时间点明显上调.核盘菌接种处理后，epfl1、epfl2、epfl3、epfl4、epfl5、epfl6和epfl9拟南芥单突变体叶片的病斑面积与野生型拟南芥(WT)相似，且DAB染色显示的H_2O_2含量也与WT没有明显的差别；epfl1,2,4,6四突变体拟南芥叶片的病斑面积明显大于WT.DAB染色结果显示，与WT相比，epfl1,2,4,6四突变体拟南芥的H_2O_2含量明显增多.荧光定量PCR结果进一步显示，与WT相比，核盘菌抗病相关基因YDDs在epfl1,2,4,6四突变体拟南芥接种核盘菌前后的表达量均明显下调.这说明EPFL1、EPFL2、EPFL4和EPFL6在拟南芥应答核盘菌的防御反应过程中存在冗余功能，通过介导YDDs基因的表达，共同调控植物免疫反应.

为明确PH-START1(At2g28320)调控拟南芥生长发育的功能,利用Real-time PCR技术对PH-START1在不同生长时期拟南芥的不同器官中的表达情况进行了分析,明确了PH-START1的时空表达特性;通过创制PH-START1功能获得和缺失的转基因拟南芥并分析其表型,明确了PH-START1在调控拟南芥生长发育过程中的生物学功能。Real-time PCR结果表明:PH-START1在拟南芥的根、叶、花、角果中都有表达。在幼苗期的根中表达量最多,在成苗期根中表达量逐渐减少;莲座叶中第6片莲座叶表达量最多,然后随着发育时间的延长逐渐减少;在花的发育过程中,随着花发育时间延长,PH-START1的表达量逐渐增多;授粉后3～5 d的角果中PH-START1的表达量最高,然后表达量逐渐降低,到授粉后9 d角果中PH-START1的表达量又略有增加。花中PH-START1在雄蕊中的表达量最高,其次是花瓣、萼片,在雌蕊中表达量最少。对PH-START1功能获得(过表达,OE)和缺失(T-DNA插入,ph-start1)的转基因拟南芥表型进行观察,分析PH-START1在调控拟南芥生长发育中的功能,发现过表达PH-START1拟南芥营养生长受到明显的抑制,地上部株型矮小、茎细弱、叶片明显变小,地下部根系发育也受到明显的抑制。这说明PH-STARTI在拟南芥生长发育中起负调控作用,为阐明和促控植物生长发育提供了理论依据。

【目的】明确拟南芥抗灰霉病基因T1N6_22在抗Pst DC3000过程中的功能,分析T1N6_22影响拟南芥对Pst DC3000的抗性原因。【方法】对t1n6_22突变体和转基因回复突变体(t1n6_22/T1N6_22)接种Pst DC3000,检测其症状;采用间苯胺蓝染色法检测接种突变体中胼胝质的积累情况;测定接种叶片中Pst DC3000的生长量,明确T1N6_22在拟南芥抗Pst DC3000过程中的功能。利用RT-PCR技术,检测SA、JA和ET对T1N6_22表达的影响及T1N6_22对抗病防御相关基因表达的影响;利用quantitative real-time PCR技术,检...

为了研究拟南芥核酸酶AtCaN2基因在植物生长发育过程中的作用与功能,从拟南芥中克隆了核酸酶AtCaN2基因,并对该基因进行生物信息学分析,亚细胞定位分析,蛋白质诱导、表达、纯化及功能研究。结果表明,AtCaN2蛋白等电点为8.45,化学式为C_(1116)H_(1788)N_(310)O_(335)S_3,共含有3 552个原子数,为亲水性蛋白;AtCaN2与十字花科亚麻荠的同源性较高,同源性为87.89%,与谷子、高粱和玉米的同源性较低,同源性分别是56.42%,57.35%,56.47%,且在氨基酸序列中间具有高度保守的D-X-D序列;同时进化树分析显示AtCaN2与十字花科亚麻荠的亲缘性最近,与谷子、玉米等禾本科植物的亲缘性比较远,这些结果同氨基酸序列比对的结果一致;亚细胞定位结果显示其定位于细胞质,与预测结果相符;蛋白质诱导和纯化得到大小约为35 ku的His-AtCaN2融合蛋白;Western Blot分析显示,诱导表达的融合蛋白正确翻译表达,且没有出现结构上的断裂或者降解的情况;小量诱导和大量诱导均有点突变后的His-AtCaN2(M)融合蛋白表达,且纯化后得到了点突变His-AtCaN2(M)较单一的条带;蛋白酶活性分析表明,His-AtCaN2融合蛋白对核酸底物具有降解能力,表现出较高的活性,而His-AtCaN2(M)点突变融合蛋白对核酸底物没有降解能力,底物基本上未降解。研究结果可以为下一步在植物体内研究AtCaN2基因的相关机理作用提供基础。

【目的】分析拟南芥中仅含START结构域(the lipid/sterol-binding St AR-related lipid transfer protein domains)亚家族成员的启动子元件及表达特性,阐明启动子元件与表达特性的相互关系,为明确仅含START结构域亚家族的生物学功能,解析植物生长发育机理、更好地促控植物生长提供理论依据。【方法】利用生物信息学方法分析仅含START结构域亚家族6个成员的亲缘关系及各自启动子区所包含的所有元件,对启动子元件的功能进行分析和分类;利用real-ti

将蔗糖非发酵基因相关蛋白激酶AKIN11克隆到植物表达载体pEGAD的35S启动子下游与GFP融合,基因枪法导入洋葱表皮细胞进行瞬时表达,发现集中在细胞核内表达.农杆菌介导花序浸泡法转化拟南芥,Basta筛选和RT-PCR鉴定得到两个遗传稳定的T3代转基因株系.突变体和野生型的表型没有明显差异,但突变体叶片中淀粉含量较野生型增加.RT-PCR分析淀粉合成途径关键酶的mRNA水平,发现突变体中腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶表达量增加,而α-淀粉酶却没有变化.表明AKIN11基因可能在拟南芥淀粉积累途径中起着重要的调节作用.

【目的】分析拟南芥中功能未知基因PMRP(putative membrane related protein)的表达特性;明确PMRP在调控拟南芥生长发育过程中的作用。【方法】利用生物信息学方法,寻找拟南芥中与PMRP含相同结构域的基因,并绘制进化树;利用Real-time PCR技术分析PMRP在生长8和21 d的拟南芥根、茎中的相对表达量,比较生长21 d的拟南芥第1、2、3、4对莲座叶及茎生叶中PMRP的表达情况,分析花器官的萼片、花瓣和雄蕊及生长后期拟南芥种子中PMRP的表达量的高低;构建35S::PMRP过表达载体,转化Columbia野生型拟南芥,通过RT-PCR技术验证PMRP的...

［目的］ｅｘｏｃｙｓｔ是真核生物中普遍存在的囊泡拴系因子复合体。在模式植物拟南芥中，ｅｘｏｃｙｓｔ复合体参与多种重要的细胞生物学过程，如生长素运输、细胞极性生长、细胞板形成和细胞自噬等。探索ｅｘｏｃｙｓｔ复合体更多的生物学功能，对于了解ｅｘｏｃｙｓｔ复合体作用的分子机制具有重要意义。［方法］以ｅｘｏｃｙｓｔ复合体亚基ｓｅｃ８基因花粉拯救的孢子体突变体ＰＲｓｅｃ８ｍ１为材料，通过台盼蓝、ＤＡＰＩ、ＤＨｃＦ－Ｄｃ等染料染色，结合遗传学试验分析其主根发育表型。［结果］发现ｅｘｏｃｙｓｔ复合体亚基ｓｅｃ８基因突变导致主根细胞程序性死亡（ＰｃＤ），阻断水杨酸信号传递途径不能缓解这种ＰｃＤ表型。［结论］ｅ．．．

【目的】冷激蛋白（CSPs）是普遍存在于原核和真核生物中的一类蛋白，能够参与冷、干旱和盐等非生物胁迫。在胡杨中，冷激蛋白的抗逆功能还少有研究。本文旨在通过研究胡杨PeCSP1在植物耐盐性中的作用，进一步揭示植物耐盐的生理与分子机制。【方法】参照NCBI数据库信息，使用primer5设计引物，利用Mega7软件进行多重序列比对及进化树分析，利用荧光定量PCR检测基因表达量。以转基因株系PeCSP1(OE1、OE2)，野生型，转空载体为材料，对各基因型拟南芥进行不同盐浓度处理，从生理生化及分子生物学角度研究胡杨PeCSP1在盐胁迫中的响应机制。【结果】胡杨PeCSP1与毛果杨PtCSP1蛋白序列相似度高，亲缘关系较近。在短期盐胁迫下，胡杨叶片PeCSP1基因下调表达。在NaCl(75、100、125 mmol/L)处理后，过表达PeCSP1拟南芥植株种子萌发率和根长的下降幅度高于野生型（WT）和转空载体（VC），而且转基因拟南芥根细胞中Na~+含量显著高于WT和VC。盐胁迫下，WT和VC抗氧化酶（SOD、POD、CAT）的活性显著上升，酶活提高的幅度明显高于OE1、OE2。在土培条件下，盐处理12 d后，转基因株系的最大光量子效率未有明显下降，但相对电子传递效率、实际光合量子产量和叶绿素含量受到的抑制作用高于WT和VC。【结论】过表达胡杨PeCSP1负调控拟南芥耐盐性。

以拟南芥为研究对象,根据已知的生物信息数据,通过反向遗传学的方法,对与钴胺素合成相关蛋白CSRP基因进行分子克隆,得到该基因的基因组序列和cDNA序列,构建二元重组质粒,利用根癌农杆菌介导的花浸泡转基因方法分别转化突变体和野生型植株,进行互补试验和过表达试验,筛选转基因植株,并进一步预测其编码蛋白的亚细胞定位于叶绿体中.结果表明,在突变体中转入该基因后,转基因植株恢复野生型的表型,而在过表达的转基因植株中表型更为明显,即生长旺盛,晚花.说明该基因对于拟南芥的营养生长起促进作用,由于其功能预测与钴胺素合成相关的蛋白,推测其可能在植物营养生长中起作用.

为了了解Mo的分子功能,对26 000粒拟南芥EMS诱变突变体种子进行了筛选,鉴定出一个对正常Mo敏感的突变体4-10。在正常170 nmol/L Mo条件下,4-10突变体的根部伸长发育受到抑制,而340μmol/L Mo处理能部分恢复突变体根长。在170 nmol/L Mo条件下4-10和Col-0幼苗的根长分别为(1.56±0.13)cm和(11.89±0.71)cm;而在340μmol/L Mo条件下,4-10和Col-0的根长分别为(3.3±0.17)cm和(6.8±0.73)cm。此外,340μmol/L Mo处理能够恢复4-10异常的根形态。Mo含量测定结果表明,4-10突变体植株根部Mo含量显著低于野生型植株;除了对正常Mo敏感外,4-10突变体叶色对NH_4~+也敏感,其花青素含量显著高于Col-0。为了鉴定4-10突变体候选基因,利用图位克隆技术将候选基因定位到1号染色体一个23 kb区域(26.809~26.832 Mb),进一步基因组重测序结果表明,在该区域存在1个非同义突变SNP,包含该SNP的基因At1g71100编码核糖-5-磷酸异构酶(RPI),初步证明,RPI基因为4-10突变体的候选基因。利用At RPI基因纯合突变植株和4-10突变体进行的等位性检测结果表明,4-10突变体和等位基因突变体rsw10-1杂交的F1仍然对NH_4~+敏感,从而确定RPI基因为4-10突变体基因。通过表型分析注意到除了过量Mo能恢复4-10突变体根长之外,外源尿苷处理同样可以恢复4-10突变体的根长。结果表明,过量的Mo通过尿苷转运作用促进了补救合成途径进程。

比较了4种外源多胺(腐胺、尸胺、精胺、亚精胺)缓解拟南芥盐害的作用,结果发现0.01 mmol.L-1精胺的缓解效果最好。对不同浓度NaC l处理下内源多胺含量进行测定,发现随着盐浓度的增加,游离态亚精胺含量显著下降,而精胺含量逐渐升高。0.01 mmol.L-1的外源精胺处理可以降低100 mmol.L-1NaC l处理下植株体内的Na+/K+。上述结果表明,精胺对拟南芥幼苗盐胁迫下离子平衡的调节作用可能是其缓解盐害的一个重要机制。

【目的】盐胁迫是影响植物生长发育的不利环境因子。蛋白激酶PKS5作为植物盐超敏感信号转导途径的重要组分，在植物响应盐胁迫过程中具有重要调节功能。本文旨在生理水平和分子水平上，探究胡杨PePKS5基因在植物耐受盐胁迫过程中的调节作用。【方法】克隆胡杨PePKS5基因，并在拟南芥中过表达，获得T_3代转基因拟南芥纯合体。观察盐胁迫下转基因拟南芥株系的耐盐表型，测定其过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶活性及盐胁迫响应基因的表达量。利用非损伤微测技术测定转基因拟南芥株系根尖Na~+、K~+动态离子流，利用激光共聚焦显微镜观测转基因拟南芥株系根尖Na~+和H_2O_2含量。测定盐处理后转基因拟南芥土培幼苗的叶绿素荧光参数、光合参数等生理指标，揭示PePKS5基因在盐胁迫下对拟南芥的生理调节作用。构建亚细胞定位载体，通过瞬时转化烟草，对PePKS5蛋白进行亚细胞定位观测。【结果】（1）PePKS5基因的CDS序列编码417个氨基酸，PePKS5氨基酸序列与毛白杨PtPKS5相似度最高，并且亲缘关系最近。（2）PePKS5定位于细胞质和细胞核中。（3）NaCl处理6 h后，胡杨叶片PePKS5基因表达量上调，72 h后逐渐恢复至正常水平。（4）盐胁迫下过表达PePKS5基因的拟南芥株系（PePKS5-OE10和PePKS5-OE15）的生存率和根长均明显高于野生型（WT）和转空载体（VC）株系。（5）与WT和VC株系相比，PePKS5-OE10和PePKS5-OE15株系的POD和CAT活性增强，APX1和CAT2基因的表达量均升高。（6）盐胁迫下PePKS5-OE10和PePKS5-OE15株系的Na~+外排和K~+的内流明显高于WT和VC株系，并且在根尖中积累的Na~+浓度和H_2O_2浓度明显低于WT和VC株系。（7）盐胁迫下PePKS5-OE10和PePKS5-OE15株系的叶绿素相对含量、PSⅡ最大光量子效率、实际光合量子产量和相对电子传递速率均高于WT和VC株系。（8）盐胁迫下PePKS5-OE10和PePKS5-OE15的净光合速率高于WT和VC株系，而胞间CO_2浓度、气孔导度和蒸腾速率均低于WT和VC株系。【结论】过表达胡杨PePKS5基因能够增强拟南芥对Na~+的外排能力，维持植物活性氧的平衡状态，以及保持相对稳定的光合作用能力，从而提高拟南芥的耐盐能力。