[目的]本文旨在探究脂联素受体2(AdipoR2)在C2C12肌管细胞与3T3-L1前体脂肪细胞共培养体系中对3T3-L1前体脂肪细胞葡萄糖吸收与消耗能力的影响。[方法]利用siRNA干扰AdipoR2基因表达,同时利用Transwell细胞培养小室对这2种细胞进行了共培养并检验相关基因的表达水平和细胞葡萄糖消耗能力的变化。[结果]使用siRNA干扰AdipoR2基因的表达后,3T3-L1前体脂肪细胞的AdipoR2基因和葡萄糖转运蛋白基因Slc2a1和Slc2a4表达水平显著下降,3T3-L1前体细胞每单位所消耗的葡萄糖量也显著下降。而在与C2C12细胞共培环境下,3T3-L1前体细胞中AdipoR2基因和葡萄糖转运蛋白Slc2a1、Slc2a4基因表达水平显著上调。同时,3T3-L1前体细胞单位消耗的葡萄糖量显著上升。进一步研究发现,AdipoR2能够有效调节3T3-L1前体脂肪细胞内葡萄糖转运蛋白基因的表达水平与葡萄糖的消耗能力。[结论]在C2C12肌管细胞共培体系中,AdipoR2能够加速3T3-L1前体脂肪细胞对葡萄糖的吸收。

为探讨血管紧张素II(angiotensin II,AngII)对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响,采用鸡尾酒法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化,并用油红O染色法和还原型烟酰胺嘌呤二核苷酸(nicotinamide-adenine dinuceotid,NADH)氧化速率法检测了3T3-L1脂肪细胞分化过程中胞浆脂质的累积和甘油磷酸脱氢酶(glycerol phosphatedehydrogenase,GPDH)的活性。结果表明,100 nmol/L的AngII可显著增大3T3-L1前脂肪细胞分化过程中胞浆脂质累积和GPDH活性(P<0.01),外源性AngII可促进3T3-L1前脂肪细胞的分化...

【目的】运用si RNA沉默小鼠前体脂肪细胞3T3-L1的细胞信号负调控因子3基因(SOCS3),探讨SOCS3在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导3T3-L1细胞凋亡中的作用。【方法】体外培养3T3-L1细胞,用0,20,40,60,80,100,150,200 ng/mL TNF-α处理细胞24 h后,观察细胞凋亡情况。利用脂质体LipofectamineTM2000,用化学合成的SOCS3小干扰RNA(si RNA)转染3T3-L1细胞,用100 ng/mL TNF-α刺激24 h,荧光显微镜下观察细胞凋亡的变化,RT-PCR检测SOCS3、c-myc和survivinmRNA的表达情况...

【目的】探讨甘薯sporamin蛋白对3T3-L1前脂肪细胞分化与增殖的影响,为开发预防和治疗肥胖、糖尿病的保健食品提供理论依据。【方法】采用硫酸铵沉淀、离子交换、凝胶过滤层析的方法对‘55-2’甘薯中的sporamin蛋白进行分离纯化。然后,以黄连素为阳性对照,用不同浓度sporamin(0、0.025、0.125、0.250、0.500、1.000mg·ml-1)处理3T3-L1前脂肪细胞。采用油红O染色和比色定量检测细胞内脂肪生成及细胞分化程度,以MTT法检测细胞的增殖。【结果】经离子交换、凝胶层析可纯化出高纯度的sporamin蛋白A和B(相对分子量分别为31kD和22kD)。与空白相...

［目的］本文旨在研究核受体共激活蛋白２（ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ ２，ｎｃｏａ２）对猪肌内前体脂肪细胞分化能力的影响。［方法］用荧光定量ｐｃｒ（ｑｒｔ－ｐｃｒ）法检测ｎｃｏａ２在猪肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达变化；通过ｎｃｏａ２小干扰ｒｎａ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｒｎａ，ｓｉｒｎａ）抑制内源ｎｃｏａ２的表达，并用油红ｏ染色检测沉默ｎｃｏａ２对肌内前体脂肪细胞分化能力的影响，通过ｑｒｔ－ｐｃｒ检测沉默ｎｃｏａ２对脂肪分化关键基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒγ，ｐ．．．

【目的】探讨Rho分子信号通路阻断剂盐酸法舒地尔(HA1077)对C3H10T1/2细胞体外增殖及成脂分化的影响。【方法】体外培养C3H10T1/2细胞株,用HA1077浓度梯度培养液(0(对照组),20,40,60,80,100μmol/L)对其进行处理,通过MTT比色法和油红O染色法分别检测C3H10T1/2细胞的增殖和分化情况。【结果】HA1077对C3H10T1/2细胞的体外增殖有一定的抑制作用,且呈现出一定的浓度依赖性。但HA1077可提高C3H10T1/2细胞的成脂分化效率,也呈浓度依赖性;且当HA1077浓度大于60μmol/L后,细胞成脂分化率与对照组差异极显著(P<0.01)...

【背景】脂肪酸转运蛋白1(FATP1)能够促进哺乳动物脂肪酸摄取，该过程对维持机体脂代谢平衡十分重要，也对家畜的肉质好坏有着重要影响。【目的】通过获得山羊FATP1的CDS区序列，检测该基因在山羊不同组织中的表达量，探究其对山羊肌内脂肪细胞脂质代谢的影响，为进一步揭示FATP1在山羊脂代谢中的作用机制提供参考，为山羊的遗传育种改良提供理论依据。【方法】利用RT-PCR方法克隆获得山羊FATP1的CDS区序列，利用在线工具分析其亲疏水性、跨膜区域、信号肽等生物学特性，并构建其氨基酸序列系统进化树。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测FATP1在山羊不同组织中的表达水平，构建其组织表达谱。利用构建的真核表达载体和筛选出的siRNA对山羊肌内脂肪细胞进行FATP1过表达和干扰处理，通过油红O染色和甘油三酯测定检测FATP1过表达和干扰后对山羊肌内脂肪细胞脂质沉积的影响，并通过RT-qPCR技术进一步探究该基因过表达和干扰后对脂质代谢相关基因表达的影响。【结果】克隆获得了FATP1CDS区1 941bp，共编码646个氨基酸残基，预测其分子式为C_(3196)H_(5026)N_(884)O_(898)S_(25)，推测该蛋白为碱性疏水稳定蛋白。三级结构预测显示，山羊与绵羊的FATP1蛋白质三级结构相似，而与牛的FATP1蛋白质三级结构略有不同。氨基酸序列系统进化树分析显示，山羊FATP1与绵羊亲缘关系最近。RT-qPCR检测发现FATP1在山羊小肠中表达量最高。油红O染色及甘油三酯测定表明过表达FATP1后山羊肌内脂肪细胞内脂滴数量增多，脂质含量增加，而干扰FATP1后则得到了相反的结果。进一步检测脂质代谢相关基因的表达变化，发现在山羊脂肪细胞中过表达FATP1后，脂肪酸合成、转运等相关基因AGPAT6(P<0.01)、PLIN1(P<0.01)、DGAT2(P<0.01)、FADS2(P<0.01)、FADS1(P<0.01)、ACSL1(P<0.01)及ELOVL3(P<0.05)的表达水平显著升高，而脂解相关基因ACOX1(P<0.01)的表达水平则显著降低；干扰FATP1后，脂肪酸转运、延长等相关基因SCD5(P<0.01)、FABP3(P<0.05)的表达量显著下降，脂解相关基因ACOX1(P<0.01)和CPT1B(P<0.05)的表达量显著上升。【结论】FATP1可能通过促进细胞脂质生成相关基因的表达，降低脂质降解相关基因的表达，从而显著促进山羊肌内脂肪细胞脂质的沉积，这些结果为进一步揭示FATP1在调控脂质代谢中的作用及分子机制提供了试验参考。

【目的】探讨SOCS3对3T3-L1细胞凋亡的影响。【方法】以小鼠脂肪组织提取的RNA为模板,用RT-PCR扩增SOCS3基因,将其克隆至pMD18-T Simple,构建pMD18-T-SOCS3重组质粒,经测序验证后,以pMD18-T-SOCS3为模板扩增SOCS3基因,将其克隆至pEGFP-N1,构建真核重组质粒pEGFP-N1-SOCS3,测序正确后,将重组质粒pEGFP-N1-SOCS3转染3T3-L1细胞,荧光下观察GFP的表达,RT-PCR和Western blotting检测细胞内SOCS3mRNA和蛋白的表达,观察细胞凋亡的变化。【结果】测序表明,pMD18-T-SOCS3和...

设置养分贮存损失状态不同的4类培养液,分别添加一定浓度梯度的L-谷氨酰胺(L-G lu tam ine,L-G ln)培养大鼠前体脂肪细胞。通过形态学观察、M TT比色、油红O染色提取法,比较各组细胞形态及增殖与分化的效果。结果表明,添加0 mm o l/L L-G ln的新鲜培养液和配制后4℃冷藏20 d,再添加0.685 mm o l/L L-G ln的培养液,均较利于前体脂肪细胞的增殖与分化;配制后4℃冷藏90 d的培养液,对前体脂肪细胞培养效果较差,添加L-G ln也不能使培养效果得到改善。另外,启封后的M 199和胎牛血清(F eta l C a lf Serum,FCS)分别冷藏不...

【目的】腺苷甲硫氨酸转移酶(MAT)在ATP的作用下,催化生成体内重要的甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)。通过构建慢病毒介导的pLenti-H1干扰载体,探究腺苷甲硫氨酸转移酶MAT2A和MAT2B对猪肌内脂肪细胞分化的影响。【方法】无菌条件下采集3—7日龄小猪背最长肌,采用差速贴壁法分离猪肌内脂肪细胞。根据GenBank中猪MAT2A基因序列(AccessionNo.NM_001167650.1)和MAT2B基因序列(AccessionNo.NM_001142832.1),获得其CDS序列。利用Invitrogen公司在线软件BLOCK-iTTM RNAi Designer分别设计shRNA靶序列,将合成的单链寡核苷酸退火形成双链,与经过Bam H I和Xho I (TaKaRa)双酶切后的pLenti-Hl载体连接,转化,并提取质粒进行酶切和测序鉴定。采用X-tremeGENE-HP DNA转染试剂与测序成功的重组质粒以及包装质粒(CMV-Δ8.9和CMV-VSVG)共转染293T细胞,48 h后观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,并进行滴度测定。在猪原代脂肪细胞密度达到70%—80%时,侵染病毒;细胞密度融合时诱导分化。提取分化第8天的猪肌内脂肪细胞的RNA,按照反转录试剂盒操作说明进行反转录,合成cDNA第一链。采用primer primer 5软件设计MAT2A、MAT2B、PPARγ、aP2、CEBP/α、β-actin基因的定量引物,实时定量和Western blot试验检测MAT2A和MAT2B基因的干扰效率。油红O染色和实时定量鉴定MAT2A和MAT2B基因对猪肌内脂肪脂质积累的影响。【结果】酶切及测序证明重组慢病毒载体pLenti-Hl-MAT2A/MAT2B构建成功;包装的慢病毒sh-MAT2A和sh-MAT2B病毒滴度分别为6.7×107和7×107 pfu/mL,侵染肌内脂肪细胞72 h后,可出现90%的绿色荧光蛋白(GFP),表明所包装的病毒可满足侵染猪前体肌内脂肪细胞需要。实时定量结果显示其显著抑制了MAT2A和MAT2B的m RNA水平表达,其干扰效率分别在70%和60%以上;进一步采用Western blot试验及蛋白分析表明,干扰MAT2A基因后,MAT2A蛋白表达水平降低40%左右,差异达到极显著水平(P<0.01);干扰MAT2B基因后,MAT2B蛋白表达水平降低25%左右,差异达到显著水平(P

为分析山羊KLF16对肌内前体脂肪细胞分化的调控作用,利用RT-PCR克隆得到山羊KLF16基因序列,利用生物信息学分析山羊KLF16基因序列特征,通过过表达、油红O染色和qPCR等方法从形态学及分子水平分析过表达山羊KLF16后肌内脂肪细胞脂滴积聚及分化标志基因表达水平的变化。结果表明:1)克隆得到包含CDS区的山羊KLF16基因序列986bp,编码251个氨基酸,具有典型锌指结构;2)KLF16在山羊各组织广泛表达,其中腹部皮下脂肪组织表达量极显著高于其他组织(P<0.01);3)过表达山羊KLF16与对照组相比脂肪细胞脂滴积聚减少,分化标志基因PPARγ和PPARα极显著下调(P

【背景】脂肪组织分为皮肤下的皮下脂肪组织(subcutaneous adipose tissue,SAT)和腹部内器官周围的内脏脂肪组织(visceral adipose tissue,VAT),皮下脂肪作为影响肉类美味与否的重要因素,探究皮下脂肪沉积分子调控机制对于育种改良和畜牧业的发展至关重要。Krüppel-like factors 12 (KLF12)是一个进化保守的转录因子,可以在多种细胞类型中表达并控制着广泛的细胞过程。【目的】研究获得山羊KLF12的分子特征并进行生物信息学分析,同时明确KLF12在山羊组织和细胞中的表达模式以及干扰KLF12对山羊皮下脂肪细胞分化的调控作用,为进一步研究KLF12在脂肪沉积过程中的潜在作用提供理论依据。【方法】利用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)方法克隆山羊KLF12完整编码序列(coding sequence,CDS)区,使用在线生物信息学分析软件对山羊KLF12核苷酸序列和氨基酸序列进行分析。利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)技术检测KLF12在山羊心脏、肝脏、腹部脂肪、皮下脂肪、臂三头肌、背最长肌等14个组织中的表达水平,以及诱导分化不同时间段KLF12在皮下前体脂肪细胞中的表达水平。随后,试验通过化学合成山羊KLF12小干扰RNA(si-KLF12),使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂将山羊si-KLF12序列转染到体外培养的山羊皮下前体脂肪细胞中。使用100μmol·L-1油酸导液诱导脂肪细胞分化。利用油红O以及Bodipy染色方法和qRT-PCR技术分别从形态学以及分子生物学的角度阐明干扰KLF12对皮下前体脂肪细胞脂滴积聚和脂肪分化标志基因mRNA表达水平的影响。【结果】试验成功获得包含开放阅读框(open reading frame,ORF)(1 209 bp)的山羊KLF12(1 315 bp,编码402个氨基酸)。亚细胞定位结果显示KLF12主要位于细胞核,此外,KLF12无跨膜结构域和信号肽,且在317—341、347—371及377—399氨基酸处存在3个典型的锌指结构域(ZnF_C2H2)。组织表达谱结果显示KLF12在山羊心脏和脾脏的表达水平极显著高于其他组织(P<0.01)。结合形态学观察结果以及脂肪分化标志基因表达水平变化情况,推测KLF12在皮下脂肪细胞分化过程中起到负调控作用。【结论】通过对山羊KLF12的分子生物学特征、组织细胞间的表达规律以及对山羊皮下脂肪细胞分化过程的潜在调控作用的研究表明,KLF12是山羊皮下脂肪细胞分化过程中的负调控因子,并且这种作用可能是通过调控LPL、PPARγ和Pref-1实现的,为进一步探究KLF12在调控脂肪细胞分化过程中的分子机制奠定了基础。

【目的】为阐明同一个miRNA簇基因(miR-665,miR-127-5p,miR-136-3p,miR-136-5p,miR-432-5p,miR-432-3p和miR-433)在不同组织山羊表达特征和成肌细胞中表达水平。【方法】本研究采用qRT-PCR方法检测miRNA簇基因在山羊组织以及C2C12细胞不同生肌时间点的动态表达模式。【结果】miRNA簇基因(miR-665,miR-127-5p,miR-136-3p,miR-136-5p,miR-432-5p,miR-432-3p和miR-433)在不同波尔山羊组织中均广泛表达。miR-127-5p,miR-136-3p, miR-432-5p,miR-432-3p和miR-433在山羊肌肉中高表达,miR-136-5p和miR-665在肌肉表达量低。miR-136-3p表达量随肌细胞增殖和分化逐渐升高;miR-127-5p,miR-432-3p,miR-432-5p,miR-433和miR-136-5p表达量呈现先升高后降低的趋势;miR-665在随C2C12细胞增殖和分化表达逐渐降低。【结论】本研究结果为进一步阐明miRNA簇基因调控骨骼肌的生长发育的调控功能奠定了理论基础。

【目的】建立牛前体脂肪细胞的体外分离培养方法,研究牛前体脂肪细胞的生物学特性和分化特征,为研究牛脂肪发育和脂肪沉积的机制提供一种简便有效的细胞模型。【方法】采用Ⅰ型胶原酶消化法自新生牛脂肪组织中获得前体脂肪细胞,对培养的牛前体脂肪细胞进行形态学观察、生长曲线测定、油红O染色及脂肪细胞标志基因LPL、PPAR-r和脂联素表达研究。【结果】80%的牛前体脂肪细胞接种后12h开始贴壁,4d后开始向脂肪细胞转化,10d后绝大部分细胞脂滴融合,细胞脂肪含量增加;分离的牛前体脂肪细胞接种后1~2d生长缓慢,3~8d进入对数生长期,9d后进入平台期,之后细胞数目开始下降。经胰岛素诱导分化过程中,LPL在牛前...

【目的】研究SMAD2在Activin A促进人胚胎干细胞向限定性内胚层诱导分化中的作用。【方法】在人胚胎干细胞中转染SMAD2基因siRNA或者过表达质粒后,收集经Activin A分别诱导0,6,12,24,48,72,96和120h的细胞各100ng/mL,采用实时定量PCR检测SMAD2与内中胚层共同前体标记Brachyury和内胚层标记Sox17的表达,进一步通过Western-blot分析Activin A诱导中SMAD2和磷酸化SMAD2(p-SMAD2)表达的变化。【结果】在Activin A诱导人胚胎干细胞向限定性内胚层细胞分化的过程中,干扰SMAD2后48h时才检测到Bra...