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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李守信 李长友 郑桂玲 吴文君 李国勋
报道了1株粉纹夜蛾转P35基因工程细胞系,命名为Tn5B-35。苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(Au-tographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus,AcMNPV)在该细胞系中连续传代至25代,与原始细胞系Tn5B1-4相比较,其感染率、多角体产量、滴度以及杀虫毒力的变化趋势均比较平稳,并未出现"传代效应"。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王媛 白贵斌 王娟 曾瑾 刘晓明 李勇
【目的】探讨p53通路在结核分枝杆菌(MTB)感染肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)中的免疫调控作用。【方法】将供试的p53基因过表达和干扰载体转染293T细胞,对其作用效果进行验证。利用脂质体分别转染p53基因过表达和干扰载体到AECⅡ细胞系A549中,建立p53基因过表达和干扰A549系模型细胞。用牛结核分枝杆菌减毒株(BCG)分别感染未经任何处理的A549细胞(感染对照组)及模型细胞,以未感染BCG的各类A549细胞为参照。以β-actin为内参基因,通过实时荧光定量PCR和Western blot来分析信号分子p53、p300、NF-κB、TLR-4、TRAF6在mRNA和蛋白水平的表达,以及炎症细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-8的mRNA表达情况。【结果】过表达载体plRES2-EGFP-p53 WT和干扰载体TP53-RNAi(2648)作用效果明显,成功建立了p53基因过表达和干扰的A549细胞模型。BCG感染的对照组、p53基因过表达组和干扰组的A549细胞中,p53、p300、NF-κB、TLR-4、TRAF6在mRNA和蛋白水平的表达显著或极显著高于相应的BCG未感染组,其中p300表达与p53基因表达量呈正相关,NF-κB、TLR-4、TRAF6表达与p53基因表达量呈负相关;BCG感染可引起TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-8的显著表达,且与p53基因表达量呈负相关。【结论】BCG感染A549细胞时,p53信号通路中的p53协同p300来抑制NF-κB、TLR-4和TRAF6的活化及负调控TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-8的分泌,从而抵抗MTB的侵染。
[期刊] 水产学报
[作者]
王英英 李凯彬 刘春 王庆 曾伟伟 石存斌 吴淑勤
为了构建剑尾鱼脑细胞系并探讨其细胞色素P4501a(CYP1A)基因的诱导效应,实验通过胰蛋白酶消化法对剑尾鱼脑组织进行体外培养,经连续继代培养,建立了可稳定传代的脑细胞系,命名为SFB。SFB最适培养液为含有15%胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12和L-15等比混合培养液,培养条件为27℃,5%CO2。生长特性研究表明,第65代细胞的群体倍增时间为43.048h,显示出旺盛的生长和分裂能力。染色体分析发现,培养细胞的染色体众数为48条,SFB核型公式为2n=2st+46t,臂指数(NF)=48,与剑尾鱼一致。诱导实验表明,SFB在10-8～10-5mol/L的苯并(a)芘诱导下,CYP1...
关键词：
剑尾鱼 脑细胞系 细胞色素P4501A
[期刊] 中国农业科学
[作者]
常洪雷 梁革梅 王桂荣 于宏坤 吴孔明 郭予元
【目的】将棉铃虫中肠Bt受体蛋白在真核表达系统中成功表达。【方法】用PCR方法分别扩增出对Cry1Ac毒素敏感和抗性棉铃虫的中肠氨肽酶N1(APN1)基因的去信号肽片段,将其克隆至pUC19载体,测定核酸序列后,克隆入Bac-to-Bac表达系统中杆状病毒转移载体pFastBacHTB中多角体基因启动子的下游,筛选出重组质粒pFastBacHTB/APN1并转化大肠杆菌DH10Bac,在体内进行重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组载体Bacmid/APN1。转染粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞(Tn-5B1-4),获得含APN1基因的重组杆状病毒,重组病毒感染Tn细胞后,得...
关键词：
APN 杆状病毒表达载体 Tn 表达
[期刊] 上海水产大学学报
[作者]
李聃 杨先乐 张书俊 喻文娟 陈昱
红霉素-N-脱甲基酶(ERND)是细胞色素P450 3A(CYP3A)依赖的酶类,可通过测定该酶催化代谢产物甲醛的量来反映其活性,从而评价CYP3A活性的高低。以草鱼肝细胞系(GCL)为模型,红霉素为底物,采用Nash比色法检测ERND产物甲醛含量,Lowry比色法测定细胞蛋白含量,建立鱼类细胞中CYP3A活性的简便检测方法。研究表明,底物以0.4 mmol/L作用60 m in后进行检测较为合适。细胞样品中ERND产物甲醛平均回收率为78.80%±4.37%,平均日内精密度为2.80%±1.40%,平均日间精密度为3.91%±1.45%,通过计算探针酶ERND活性可为鱼类细胞CYP3A活性的...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
刘龙 孙丽英 王敦
[目的]为克服杆状病毒杀虫速度慢等固有缺点,首次尝试将异源病毒细胞凋亡诱导基因重组到昆虫杆状病毒中,以期为遗传修饰杆状病毒、提高杀虫效果提供新思路。[方法]将带有SV40终止子的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)多角体基因ph、AcMNPV ie-1启动子、在C端融合Flag标签的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)的P7-2基因依次插入到供体质粒p Fast Bac-HTB的多克隆位点。使用供体质粒p Fast Bac-HTB自身的启动子及ie-1启动子分别启动ph和P7-2基因的表达。通过转座的方法将ph、P7-2基因及启动子插入到bacmid b MON14272的多角体位置,获得重组bacmid Ac-P7-2,并通过Western blot检测P7-2基因的表达。转染sf9细胞后通过光学显微镜观察重组病毒多角体的形成并统计不同时间细胞死亡数量。通过TCID50的方法绘制病毒生长曲线。[结果]成功构建了P7-2基因重组AcMNPV bacmid Ac-P7-2,Western blot检测到P7-2蛋白可以正确表达。在转染sf9细胞48、72、96和120 h后,重组病毒v Ac-P7-2细胞死亡数量显著高于野生型病毒v Ac-WT,并发现重组病毒v Ac-P7-2多角体形成并释放的速度也快于野生型病毒v Ac-WT。病毒的生长曲线显示,在转染sf9细胞48、72、96和120 h后,v Ac-P7-2的增殖速度显著快于v Ac-WT。[结论]成功构建了多角体形成迅速的重组病毒v Ac-P7-2,与野生型病毒v Ac-WT相比其具有较快的增殖速度,对寄主细胞有较强致死作用。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李华玮 王旭英 井汇源 万博 乔宏兴 郭科威 侯文静
旨在利用CRISPR/Cas9系统构建敲除真核翻译起始因子5A(Eukaryotic translation initiation factor 5A,eIF5A)的MARC-145多克隆细胞系，并验证该细胞系对PRRSV感染的影响。针对eIF5A基因构建并筛选成功获得重组慢病毒，用重组慢病毒感染MARC-145细胞，嘌呤霉素及有限稀释法进行筛选，获得敲除eIF5A的MARC-145多克隆细胞系。对构建细胞系进行活力检测，T7E1核酸内切酶、Real-time PCR以及Western blot验证eIF5A体外敲除效率，病毒增殖试验验证该细胞系对PRRSV复制的影响。结果表明：1)细胞活性检测结果显示敲除eIF5A基因对细胞活性无显著影响；2)通过T7E1核酸内切酶、Real-time PCR以及Western blot表明eIF5A表达显著降低，并将此细胞系命名为MARC-145-△eIF5A细胞系；3)使用PRRSV HN07-1感染MARC-145-△eIF5A,体外试验证明敲除eIF5A对PRRSV的增殖有抑制作用。综上，本研究成功构建eIF5A基因敲除的MARC-145多克隆细胞系，体外敲除eIF5A显著抑制PRRSV增殖，这将为进一步探索eIF5A调控PRRSV复制的分子机制奠定基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘爵 张杰 刘有昌 张方亮 周蛟
进行了 禽脑脊 髓炎病 毒 Ｌ２ Ｚ 株在 Ｂ Ｇ Ｍ７０ 传 代 细胞 系上 培 养特 性的 研 究。该 毒 株 在细胞上盲 传３ 代后 能产生明 显的细 胞病变，并 且传代 过程中 细胞 病变 稳定 地出 现。利 用琼 脂扩 散试验、免疫 荧光试 验、免疫酶 试验及 负染电镜 观察 研究 表 明， Ｌ２ Ｚ 株 接种 Ｂ Ｇ Ｍ７０ 细 胞具 有良 好 的增殖特性 ，并且病 毒是在细 胞浆中 进行复制 。该研究 报道禽 脑脊髓 炎病 毒能 成功 地在 传代 细胞 系上培养增 殖。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
覃鸿妮 谢钰珍 陈罡 密苗苗 彭赛男 张勇
【目的】通过慢病毒转染细胞构建稳定表达CRISPR/Cpf1的293 T和HT 1080细胞系,实现高效率基因编辑。【方法】PCR扩增AsCpf1和LbCpf1基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共转染293FT细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达LbCpf1和AsCpf1的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。用设计好的针对ABCG1基因的sgRNA转染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。【结果】成功构建了Cpf1-pLent慢病毒载体,重组载体对293 FT细胞进行慢病毒包装、浓缩与纯化后,病毒滴度均在10~6 TU/mL之上。用纯化后的病毒感染293 T和HT 1080细胞,筛选出3株能稳定表Cpf1的细胞系,目的ABCG1基因的基因编辑功能验证表明其中2株T7EΙ酶切掉带明显,sgRNA靶向敲除效率较高,命名为AsCpf1-293 T-7D和AsCpf1-HT1080 02-3B。【结论】建立了稳定表达Cpf1的293T和HT 1080细胞细胞系,可以用于目的基因的高效敲除。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘田田 蒋向 许晓东
【目的】研究苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)晚期表达因子lef-10在宿主细胞Sf9中的时空表达及定位,为进一步研究lef-10的功能提供理论基础。【方法】利用不同的特异引物,通过PCR方法扩增lef-10及innateP-lef-10目的片段,将目的片段分别克隆到载体pTriEx-SP-GFP上,得到重组质粒pTriEx-lef10-GFP和pTriEx-innateP-lef10-GFP,经过双酶切检测构建载体。将重组质粒分别与Bacmid共转染Sf9细胞,用得到的重组病毒分别于4,8,16,24,36h再次感染宿主细胞;用激光共聚焦显微镜观察lef-10的表达及亚细胞定位情况。...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
代文君 王洪梅 刘晓 高运东 于力 王立群 仲跻峰 何洪彬
【目的】构建口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1,并建立稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。【方法】采用RT-PCR技术从口蹄疫病毒材料中扩增出VP1基因,并将其连入慢病毒载体FG9中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,转染BHK-21细胞,96h后经流式细胞分选筛选GFP阳性细胞,细胞增殖后经WB检测VP1基因的表达。【结果】VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1测序正确,转染BHK-21细胞经流式细胞仪筛选的GFP阳性细胞后可稳定表达VP1基因。【结论】VP1基因重组慢病毒载体构建成功并获得了稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。
关键词：
口蹄疫病毒 VP1 转染 稳定细胞系
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张宁 杨先乐 王翔凌 林茂 喻文娟 张书俊
以乙醇为细胞色素P450 2E1的诱导剂,在CHSE-1细胞中研究了该诱导剂与酶活性之间的时间效应关系和剂量效应关系。细胞传代后培养48 h,加入含有不同浓度乙醇的新鲜培养基,孵育诱导24 h,之后加入底物苯胺反应30 min。以苯胺的代谢产物4-氨基酚的生成量来反映CYP2E1活性。苯胺浓度为10～16 mmol/L时CYP2E1活性最大,可达(0.152±0.095)nmol.min-1.mg-1,该浓度范围的苯胺适合用于指示CYP2E1的活性。以Gentox模型对诱导的剂量效应进行拟合,得到一个先升高后降低的曲线,说明乙醇对CHSE-1细胞中CYP2E1有先诱导后抑制作用。拟合方程F(x...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
张聪 蒲志刚 张婷 李明 屈会娟 谭文芳 杨松涛 王大一 阎文昭
选取8个四川主栽甘薯品种为材料,剥离茎尖诱导胚性愈伤组织,建立胚性细胞悬浮培养系。以烟草叶片和川薯20悬浮细胞为受体材料,利用农杆菌浸染方法转化抗除草剂基因EPSPS。结果表明,经PCR检测及草甘膦喷施试验后,获得了抗草甘膦阳性甘薯植株13株、阳性烟草植株25株,此实验为以EPSPS基因作为遗传转化的标记基因提供了帮助。
关键词：
甘薯 悬浮细胞 草甘膦 除草剂 遗传转化
[期刊] 西南农业学报
[作者]
周晓罡 丁玉梅 孙茂林 陈亮 苏源 张绍松 李成云
以IRR I-Japan 24个水稻抗稻瘟病单基因鉴别品系和对照普感品种丽江新团黑谷(LTH)的成熟种胚为材料诱导愈伤组织,诱导过程中发现不同基因型愈伤组织诱导能力差异极大,愈伤组织诱导率在14.3%~97.1%,将2,4-D浓度从3.0 mg/L提高到5.0 mg/L时,可提高愈伤组织诱导率。经诱导成功的水稻愈伤组织继代培养一段时间后,不同基因型的愈伤组织继代特性出现明显差异,选取生长状态良好的单株系愈伤组织建立了水稻悬浮细胞系,悬浮培养过程中对胚性悬浮系的细胞形态变化进行了观察,发现细胞的形状由开始的不规则、长条形逐渐转变成近椭圆形、椭圆形;细胞质由很淡、透明、具明显的大液泡逐渐转变成浓厚...
关键词：
愈伤组织 悬浮细胞系 单基因系 水稻
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
杜晓映 张振文 夏惠 徐国前
【目的】建立适合葡萄悬浮细胞系快速稳定生长的培养体系。【方法】以鲜食葡萄巨峰的果皮为材料,以B5为基本培养基,通过选择合适的激素配比及浓度、pH、蔗糖浓度等建立并优化葡萄愈伤组织培养体系及细胞悬浮培养体系。【结果】在B5+0.5 mg/L 6-BA+NAA条件下,NAA最适质量浓度为1 mg/L;在B5+0.5 mg/L 6-BA+2,4-D条件下,2,4-D最适质量浓度为1.0~2.0 mg/L;在B5+1 mg/L NAA+6-BA条件下,6-BA最适质量浓度为0.5~1.0 mg/L;在B5+2 mg/L 2,4-D+KT条件下,KT的最适质量浓度0.2 mg/L。在最佳蔗糖质量浓度30...
关键词：
巨峰葡萄 愈伤组织 悬浮细胞 培养体系
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