【目的】研制可同时鉴别检测AI、ND、IB、IBD等4种禽病血清抗体的可视化蛋白芯片。【方法】用超速离心法和蔗糖密度梯度法分别纯化了4种病毒蛋白抗原,调整到合适浓度后点于醛基修饰的片基上,制备蛋白芯片;分别用4种禽病阳性血清杂交,再与金标二抗杂交,银染显色后读取结果,建立4种禽病的可视化蛋白芯片工作平台;进一步对此芯片的特异性以及灰度值与抗体浓度的相关性进行了研究;最后对18个现地血清样品进行了初步应用检测。【结果】结果显示经过条件优化后,芯片检测探针可特异性的相应的抗体进行杂交,呈现较强的杂交信号,且无交叉杂交。信号灰度值在抗体浓度为50～300μg·ml-1范围内成线性关系。用芯片和其它传...

用体外表达的蛋白作为免疫原来制备特异的单克隆抗体,并对制备的抗体进行鉴定。将ARVσ3蛋白基因在体外扩增,扩增产物与载体PGEX-4T-1连接并在基因工程菌中表达,体外表达的蛋白经纯化后作为免疫原来制备特异的单克隆抗体和ELISA检测包被抗原,测定纯化后蛋白的浓度,按每鼠100μg的蛋白用量免疫BALB/c小鼠,免疫4次后取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1进行融合。对融合后的杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经3次有限稀释法克隆,通过间接E-LISA方法测定其抗体效价,并通过Western Blot、Dot-ELISA、直接免疫荧光、病毒中和等方法对获得的单抗特性进行检测。结果通过纯化的病毒含量...

用适宜摩尔浓度的异型双功能交联剂SPDP将R-藻红蛋白与纯化的禽流感病毒H9亚型多克隆抗体交联,并经高效液相色谱纯化制备R-藻红蛋白标记抗体荧光探针。以溴化氰活化的琼脂糖微球为固相载体,采用双抗体夹心法建立固相免疫荧光检测法,以制备的R-藻红蛋白标记抗体荧光探针检测禽流感病毒H9尿囊毒。结果表明,阳性微球在蓝、绿光激发下发射桔黄色荧光,荧光明亮,无背景光干扰,特异性好,灵敏度高,可检测蛋白浓度为1.85×10-5mg.mL-1的H9亚型尿囊毒。R-藻红蛋白标记探针的检测灵敏度高于FITC标记探针,R-藻红蛋白可替代FITC或与FITC等荧光染料一起用于多色荧光免疫检测。

制备抗大鲵虹彩病毒（ＣＧＳＩＶ）ＭＣＰ ＣＯＥ蛋白的单克隆抗体，并对其基本特性进行鉴定及开展初步应用。用纯化的重组ＣＧＳＩＶ ＭＣＰ ＣＯＥ蛋白免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，取免疫小鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合，间接ＥＬＩＳＡ法检测阳性孔，经有限稀释法亚克隆，筛选单克隆杂交瘤细胞株。采用间接ＥＬＩＳＡ法、免疫印迹法和单克隆抗体亚型检测试剂盒等鉴定单抗的稳定性、特异性和亚型；采用腹水诱生法制备单抗腹水，饱和硫酸铵法纯化腹水单抗；间接ＥＬＩＳＡ法分别测定单抗杂交瘤细胞上清液和腹水单抗的效价；利用间接免疫荧光法观察ＣＧＳＩＶ的增殖。结果显示，细胞融合克隆率为９８．６８％，阳性率为２０．５２％，得到１株．．．

【目的】制备鸭瘟病毒（ＤＰＶ）ｇＢ蛋白单克隆抗体，为建立ＤＰＶ快速诊断方法及进一步鉴定ＤＰＶ的抗原表位奠定基础。【方法】克隆ＤＰＶｇＢ基因，构建其表达载体并进行原核表达，纯化ＤＰＶ ｇＢ蛋白，以其作为抗原免疫８周龄ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合，进行间接ＥＬＩＳＡ及亚克隆筛选，并对单抗亚类及抗原性进行鉴定。【结果】ＰｃＲ扩增出９１５ＢＰ的目的基因，成功连接于ＰＥＴ－２８Ａ载体，并转化大肠杆菌ＲｏＳＥＴＴＡ进行诱导表达，获得４株稳定分泌抗ＤＰＶ ｇＢ蛋白的杂交瘤细胞株，分别命名为Ａ８Ｄ７、Ｅ６ｃ３、Ｈ１１Ｆ８、Ｈ６Ｆ６，间接ＥＬＩＳＡ检测其腹水效价分别为１∶１０３、１．．．

为了筛选P1病毒VP1蛋白的特异性单抗,通过生物信息学软件预测其抗原表位,然后利用SEALTM方法制备针对不同抗原表位的单抗,再通过免疫组化试验和Western Blot对其中6株进行分析,筛选敏感性强、特异性好的单抗。结果显示,选取的6株单抗中有3株(mAb1、mAb6和mAb9)在免疫组化染色时呈阳性反应,有1株(mAb1)在Western Blot中表现强阳性。研究筛选出了P1 VP1蛋白的特异性单抗,为P1病毒的检测和疫苗研究奠定了基础。

【背景】轮状病毒（Rotavirus,RV）是全球范围内幼儿和各种幼畜急性病毒性胃肠炎的主要原因之一，在公共卫生中具有重要意义。猪轮状病毒病是一种由猪轮状病毒（Porcine Rotavirus,PoRV）引起的一种急性肠道传染病，常造成仔猪消化道功能紊乱，引发严重的呕吐、腹泻和脱水症状，一旦爆发将对养猪业造成重大经济损失。目前，针对PoRV感染尚无特效药物治疗，疫苗接种是控制感染的最经济的途径。然而，PoRV基因型多且易变异，不同基因型之间的交叉保护很不理想。因此，亟需加强对PoRV的流行病学监测和致病机制研究，探索新型防控策略。【目的】利用大肠杆菌原核系统表达PoRV NSP2、NSP4和NSP5非结构蛋白并免疫家兔获得相应多克隆抗体，为PoRV的防控和致病机制研究提供技术手段。【方法】将PoRV的NSP2、NSP4和NSP5基因进行密码子优化后，克隆到pCold-sumo载体中。将测序正确的阳性重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导获得重组蛋白。利用SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达情况。对重组蛋白进行亲和层析柱纯化和定量后，采用皮下多点注射方法接种新西兰大白兔，每隔14 d加强免疫一次，经过3次免疫后制备多克隆抗体。采用间接ELISA方法测定多克隆抗体的效价、间接免疫荧光（IFA）和Western blot验证多克隆抗体与PoRV的反应性。再通过Western blot进一步检测PoRV感染过程中3个非结构蛋白的动态表达，以及鉴定3个重组真核质粒转染的效果。【结果】NSP2、NSP4和NSP5重组菌能够有效表达目的蛋白，SDS-PAGE分析可在目标位置清晰观察到明显条带，并且目的蛋白以可溶性形式存在。3个重组蛋白制备的多克隆抗体，ELISA效价均超过1﹕81 000，表明重组蛋白免疫原性良好。IFA结果表明3个多克隆抗体均能够与优势流行基因型轮状病毒发生特异性反应，与其他常见腹泻病原无反应。Western blot结果也展示了研究制备的NSP4、NSP5多克隆抗体可用于病毒感染过程中非结构蛋白的动态表达以及真核质粒转染的鉴定。而NSP2多克隆抗体未能特异性识别到PoRV感染后的NSP2蛋白的表达，但特异性检测到NSP2重组质粒转染后的NSP2蛋白表达，这一结果可能与NSP2的表达特性有关，有待进一步研究确认。随后进行的真核质粒转染验证以及PoRV感染过程中非结构蛋白的动态表达检测结果也验证了本实验制备多克隆抗体的实用性。【结论】成功利用大肠杆菌表达了PoRV的NSP2、NSP4和NSP5非结构蛋白，并获得效价高、特异性良好的多克隆抗体，为PoRV致病机制研究和防控技术研发奠定基础。

应用Gateway重组技术构建CSBV非结构蛋白,RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)的原核表达载体,将重组表达载体转化大肠杆菌Rosetta,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside,IPTG)诱导获得RdRp基因原核表达蛋白.以重组蛋白为抗原免疫新西兰兔制备相应的多克隆抗体,Western blot检测表明,该抗体能与RdRp重组蛋白和感病中华蜜蜂幼虫蛋白特异性结合,说明获得的抗体特异性高.利用制备的抗体进行免疫荧光标记,发现其能特异地定位在感病中华蜜蜂血淋巴细胞内.

【目的】制备大口黑鲈蛙虹彩病毒主衣壳(MCP)蛋白兔多克隆抗体,以期为该病毒蛋白功能研究奠定基础。【方法】对p ET32a(+)MCP/BL21重组大肠杆菌进行诱导表达,将重组蛋白进行纯化、复性,以此为抗原免疫大耳兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价,间接免疫荧光试验(IFA)和Western Blot法分析MCP多克隆抗体的特异性。【结果】纯化的MCP重组蛋白条带特异;间接ELISA结果显示,制备的兔多克隆抗体血清效价为1∶1 024 000;IFA和Western Blot检测结果表明该多抗特异性良好,能够与大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白发生特异性反应,IFA试验表明血清最适稀释度为1∶500。【结论】成功制备了大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP兔多克隆抗体,该抗体可特异性识别大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白。

旨为制备兔抗类猪圆环病毒因子P1的特异性抗体,对其在病原学方面的应用进行研究。采用人工合成选定的表位肽,将其与载体蛋白KLH偶联后免疫新西兰大白兔制备抗P1多克隆抗体,通过免疫组化对该多抗与P1的反应性进行检测。获得了抗P1多克隆抗体;免疫组化结果显示抗体可与P1病毒蛋白出现特异性反应。偶联后的P1表位肽具有免疫原性,可用于制备相应的抗体;制备的抗体特异性良好,可用于P1病原学方面的研究。

鲤春病毒血症病毒(SVCV)能够引起鲤科鱼类大量死亡,被世界动物卫生组织(OIE)列为必须申报的重要疫病,也是我国唯一被列为一类疫病的鱼类传染病。为建立SVCV的快速免疫学诊断方法,研究其主要结构蛋白间的免疫原性差异,实验首先采用原核表达系统克隆并诱导表达,纯化SVCV的核蛋白(N)、磷蛋白(P)和基质蛋白(M),并进一步免疫新西兰白兔制备抗血清,抗血清经Protein A柱进一步纯化获得3种蛋白的多克隆抗体。利用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫印迹实验(Western blot)对抗体效价和特异

利用ＲＴ－ＰＣＲ的方法从感染水稻矮缩病毒（ＲｉＣｅ ｄｗａＲｆ ｖｉＲｕｓ，Ｒｄｖ）的水稻中克隆该病毒的运动蛋白基因ｓ６和外壳蛋白基因ｓ８，通过ＧａＴｅｗａｙ系统进行原核表达，获得表达载体Ｐ ｄｅｓＴ１７－Ｐｎｓ６和Ｐ ｄｅｓＴ１７－Ｐ８，将表达载体转化ｅ．Ｃｏｌｉ ＲｏｓｅＴＴａ，经ｉＰＴＧ诱导表达后获得分子质量约为５９和４６ ｋｕ含Ｈｉｓ标签的融合蛋白．以诱导表达的目的蛋白为抗原，免疫注射新西兰大白兔制备多克隆抗体．结果表明，ｗｅｓＴｅＲｎ ｂｌｏＴ检测制备的Ｐｎｓ６和Ｐ８抗体可特异性检测Ｒｄｖ，间接ｅｌｉｓａ测定Ｐｎｓ６和Ｐ８抗体的效价均约为６ ４００倍，并建立了可靠、灵敏、特异的ｄｏＴ．．．

【目的】制备抗鸭坦布苏病毒（Ｄｕｃｋ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ，ＤＴｍｕｖ）Ｎｓ５蛋白的单克隆抗体。【方法】将实验室保存的ＰｅＴ２８ａ－Ｎｓ５载体转化入ｒｏｓｅＴＴａ（Ｄｅ３）感受态细胞中进行诱导表达，利用纯化的鸭坦布苏病毒Ｎｓ５蛋白作为抗原免疫ｂａＬｂ／ｃ小鼠，应用淋巴瘤细胞杂交技术结合有限稀释法制备单抗，并对单抗的特异性、反应性及其抗原表位和亚类进行鉴定。【结果】筛选获得２株稳定分泌针对ＤＴｍｕｖ的Ｎｓ５蛋白单抗的杂交瘤细胞，分别命名为ａ４Ｄ１和ｂ４ｂ８。此２株杂交瘤细胞诱导ｂａＬｂ／ｃ小鼠的抗体效价均可达到１∶６４ ０００。间接ｅＬｉｓａ、ＷｅｓＴｅｒＮ ｂＬｏＴ和间接免疫荧光（ｉＦａ．．．

[目的]制备日本脑炎病毒prM蛋白的特异性单克隆抗体，对进一步了解prM的结构和功能、开发特异性检测方法以及JEV prM蛋白的功能研究奠定基础。[方法]将prM基因克隆至原核表达载体pET-32a，诱导表达并纯化prM重组蛋白，随后将其免疫小鼠，通过细胞融合和亚克隆得到分泌抗prM单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水并进行效价测定，通过Western blot和IFA验证其特异性，并进行空斑中和试验测定其中和活性，利用原核表达多段截短体蛋白确定单克隆抗体抗原表位并进行保守性分析，将其初步应用于感染检测及亚细胞定位分析。[结果]经细胞融合和三次亚克隆后成功获得1株能稳定分泌抗prM单克隆抗体的细胞株，命名为4H6，所制备的腹水效价可达到1∶1638400，经鉴定该抗体重链属于IgG2b，轻链为κ型。Western blot以及IFA试验均证明该抗体具有良好的特异性。空斑减少中和试验显示4H6不具备中和活性。通过表达截短蛋白鉴定出4H6所识别的抗原表位位于³⁰GENRCWVRAIDVGYMC⁴⁵，结合生物信息学分析发现该表位位于prM蛋白表面且在JEV不同毒株之间高度保守，有利于抗原抗体的直接接触。并成功将4H6初步应用于JEV感染检测及prM蛋白亚细胞定位分析。[结论] 成功制备1种高效且特异性的JEV prM蛋白单克隆抗体，抗原表位识别区位于pr，为分析prM蛋白在病毒复制过程中的生物学功能以及与其他病毒蛋白（如E蛋白或宿主分子）之间的相互作用提供有效工具。

为建立针对Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒（ＧＣＲＶ）的血清学检测方法，分别构建了ＧＣＲＶ ＪＸ０２株外衣壳蛋白ＶＰ４、ＶＰ３５的原核重组表达质粒ＰＧＥＸ－４Ｔ－３－Ｓ６、ＰＧＥＸ－４Ｔ－３－Ｓ１１，用纯化的重组蛋白Ｒ ＶＰ４、Ｒ ＶＰ３５分别免疫小鼠制得相应的多克隆抗体，用间接ＥＬＩＳＡ方法测定２种抗体的效价，用ＷＥＳＴＥＲｎ ＢＬｏＴ鉴定抗体的特异性。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析细菌表达的Ｒ ＶＰ４、Ｒ ＶＰ３５大小分别约为９８ｋｕ和６１ｋｕ，且都主要以包涵体的形式存在；间接ＥＬＩＳＡ方法测定制备的抗体效价分别约为１：４×１０５和１：１０６；ＷＥＳＴＥＲｎ ＢＬｏＴ结果显示，制备的２种多克隆抗体都既能够识别原核．．．