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[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
周生财 黄华宏 童再康 吴小林
采用核酸电泳缓冲液(TNE)结合十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取的高质量楠木Phoebe基因组脱氧核糖核苷酸(DNA)可满足扩增片段长度多态性(AFLP)分析的要求。利用浙江楠Phoebe chekiangensis基因组DNA优化建立楠木AFLP反应体系如下:酶切反应300 ng基因组DNA,0.3μL缓冲液4,0.3μL牛血清白蛋白(100×BSA),50nkat EcoRΙ,25 nkat MseΙ,双蒸水加至30.0μL放置37℃恒温箱酶切4 h,聚合酶链式反应(PCR)仪上65℃15min;连接反应20.0μL酶切产物,2.5μL T4缓冲液,666.8 nkat T4连接酶,5...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王大玮 李煜 周玮 李周岐
【目的】建立并优化适合杜仲的AFLP技术体系,为进一步构建其遗传图谱及开展分子标记辅助育种奠定基础。【方法】对杜仲基因组DNA提取方法、酶切与连接体系、预扩增和选择性扩增程序的影响因素进行分析,并对适合杜仲AFLP分析的引物组合进行筛选。【结果】模板DNA的提取采用改进的CTAB法,酶切模板DNA用量500 ng,酶切时间6 h,连接反应时间6 h,预扩增产物最适稀释倍数30倍。同时筛选出E-AAG+M-CAA,E-AAG+M-CAT,E-AAG+M-CTA,E-AAG+M-CTG,E-ACA+M-CAA,E-ACA+M-CTA,E-ACC+M-CTG共7对适合杜仲AFLP分析的引物组合。【结...
关键词：
杜仲 AFLP 体系优化 引物筛选
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
陈敏 陶静 马超德 尹伟伦 朱杨煜 宗世祥 骆有庆
该文以沙棘木蠹蛾幼虫为材料,用改进的SDS-蛋白酶K法获得了高质量的符合AFLP分析要求的基因组DNA。通过对AFLP试验过程中的酶切-连接、预扩增、选择性扩增等各关键因素的比较研究,建立了一套优化的沙棘木蠹蛾AFLP分子标记体系,获得了清晰的指纹图谱。研究结果表明:利用EcoRⅠ/MseⅠ双酶切系统以酶切-连接2~4 h,预扩增产物稀释20倍、Mg2+浓度为1.5 mol/mL的选择性扩增效果最好。进一步利用该反应体系从80对E+3/M+3选择性引物中筛选出10对多态性丰富、分辨率高、谱带清晰的引物组合。该研究结果为利用AFLP标记技术开展沙棘木蠹蛾的种群遗传结构、遗传分化等方面的研究奠定了...
[期刊] 林业科学研究
[作者]
姜荣波 姜景民 刘军 陈益泰 栾启福 岳华峰
为建立稳定的红楠ISSR-PCR最佳反应体系,在探索红楠基因组DNA提取的基础上,利用单因子试验和正交试验设计对反应体系进行优化。首先采用单因子试验对Mg2+、引物、模板DNA、dNTPs的不同浓度水平进行优化,找出ISSR-PCR反应各因素的最佳浓度;同时为进一步增加结果的可靠性,采用正交试验设计方法[L9(34)]对Mg2+、引物、模板DNA、dNTPs 4个因素3个浓度水平进行优化和筛选。综合两种试验方法结果,最终获得了红楠ISSR-PCR最佳反应体系:反应体系为20μL,Taq酶0.05 U.μL-1,Mg2+2.0 mmol·L-1,模板DNA 1 ng·L-1,dNTPs 0.3 ...
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
明军 张启翔 晏小兰 邱丽娟
采用改进的SDS DNA提取方法从梅花的嫩叶和老叶中提取获得总DNA .所得DNA样品的OD2 6 0 OD2 80 值在1 7～ 1 9之间 ,琼脂糖凝胶上主带清晰、较少降解、样品纯度高、蛋白去除干净且得率高 .该体系对原提取程序作了多处简化 ,使操作简便、快捷、高效 ,适合于梅花DNA提取 ,所提取的DNA样品不含PCR反应抑制剂及其他酶反应抑制剂 ,可被限制性内切酶MseⅠ和EcoRⅠ完全酶切 ,适合AFLP PCR反应应用 ,得到清晰的指纹式样 .
[期刊] 华北农学报
[作者]
张桂华 杜胜利 鞠秀芝 韩毅科 马德华 王鸣
以24个不同类型的黄瓜高代自交系为试材,通过对扩增长度多态性(AFLP)反应体系中的几个关键参数进行优化,建立了适合于黄瓜的AFLP反应体系。结果表明,用于酶切的基因组DNA以300 ng为宜,预扩增产物的稀释倍数以30倍为宜,选择性扩增引物的选择性碱基的数目以“2+3”组合为宜。采用优化好的体系,引物组合P12M12在供试材料中共扩增出稳定清晰的带纹35条,其中多态性带4条。
关键词：
黄瓜 扩增片断长度多态性 DNA指纹图谱
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
吴雪琴 徐刚标 梁艳 王家庆
利用正交设计实验对影响观光木ISSR-PCR扩增的主要因素(模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+的浓度,TaqDNA聚合酶的用量以及退火温度)进行优化,建立观光木ISSR-PCR反应的最佳体系。结果表明:最佳反应体系(20μL)为:模板DNA50 ng,引物0.4μmol/L,dNTPs 0.25 mmol/L,MgCl22.5 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.25 U。扩增反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,55℃退火30 s,72℃延伸90 s,35个循环;72℃延伸7 min;4℃保存。该反应体系的建立,为观光木遗传多样性分析提供了客观可靠的方法。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
李炎林 熊兴耀 于晓英 陈海霞 李艳香 李达
分别采用单因子试验和正交设计试验对影响红花檵木RSAP-PCR反应体系的5个因素(DNA模板量、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq酶量)在4个水平上进行优化.结果表明,2种方法得到的影响因素的最优水平存在差异,通过综合比较与分析,选取红花檵木RSAP-PCR最优反应体系为:在25μL的反应体系中,模板量70ng,Mg2+浓度1.50mmol/L,dNTPs浓度0.25mmol/L,引物浓度0.20mmol/L,Taq酶量2.50U.
[期刊] 华北农学报
[作者]
王文跃 李国瑞 黄凤兰 尚雨丝 王超 罗蕊 邱靖 王丹 张智勇 陈永胜
以蓖麻茎秆为试材,研究了影响cDNA-AFLP标记蓖麻差异基因反应体系的几个关键因素,建立了适宜蓖麻的cDNA-AFLP分析体系。结果表明:当裂解液为1.4 mL时提取的RNA浓度最高,EcoRⅠ和MseⅠ的组合6 h可将ds-cDNA酶切完全,与相应接头连接过夜后产物用于预扩增,预扩增产物稀释15倍时作为选择性扩增模板可以获得条带丰富且重复性好的结果。蓖麻cDNA-AFLP反应体系的建立为进一步研究蓖麻株高、叶型等相关基因奠定了基础。
关键词：
cDNA-AFLP 蓖麻 体系建立
[期刊] 林业科学研究
[作者]
田胜平 汪阳东 陈益存 占志勇 斯林林
通过对山苍子幼嫩叶片、顶芽、花蕾3种组织的DNA提取效果分析和对影响酶切及选择性扩增效果的4个主要因素(酶切时间、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度)的比较研究,建立了适合于山苍子AFLP分析的技术体系。结果表明,山苍子的顶芽是较好的DNA提取材料;山苍子基因组DNA经5 U EcoR I和5 U Mse I酶切1 h即可完全酶切;最佳的选择性扩增体系为20μL反应体系中含有1.0 U rTaq聚合酶、2.0μL 10×PCR缓冲液、1.8μL 25mmol.L-1MgCl2、1.4μL 2.5 mmol.L-1dNTP、100 ng.μL-1引物各1.0μL。使用该反应体系获得了清晰、稳...
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
马洪双 夏新莉 尹伟伦
以胡杨为研究材料,建立适用于胡杨抗逆研究的cDNA-AFLP反应体系,对影响反应体系的关键因素(RNA提取、内切酶组合、预扩增体系、选择性扩增体系)进行了探索和优化。结果表明:通过改进后的CTAB法能成功获得高质量的RNA;EcoRⅠ/MseⅠ的组合4.5h内将ds-cDNA酶切完全,与相应接头连接过夜后产物直接用于预扩增;稀释10倍的预扩增产物作为模板用于选择性扩增;通过优化体系得到的选择性扩增产物,银染检测后条带清晰稳定,经RT-PCR检测,证明优化后的cDNA-AFLP技术差异显示的结果可以准确反映基因在植物体中差异表达的真实情况,并利用该技术成功筛选出42对可以获得带型丰富且重复性好的...
关键词：
胡杨 cDNA-AFLP 抗逆机制
[期刊] 西南农业学报
[作者]
彭敏 陈晓汉 陈秀荔 蒋伟明 黎铭 李咏梅
为了将AFLP技术应用到企鹅珍珠贝相关研究中,以企鹅珍珠贝为材料,采用SDS-CTAB改进法DNA提取高质量的基因组DNA,通过对AFLP双酶切体系?连接体系?预扩增体系及选择性扩增体系中关键因素进行优化,建立了适用于企鹅珍珠贝的AFLP反应体系。同时以3个企鹅珍珠贝地理群体为材料,采用新建立AFLP反应体系从256对引物组合中筛选出10对多态性高的AFLP引物组合,说明建立的优化体系可用于企鹅珍珠贝的AFLP分析。
关键词：
企鹅珍珠贝 AFLP 反应体系 条件优化
[期刊] 林业科学研究
[作者]
赵敏 冯颖 和锐 陈晓鸣 冀焕红
采用CTAB法、改进SDS-蛋白酶K法、SDS-饱和氯化钠法和提取试剂盒对喙尾琵甲的肌肉、虫卵和幼虫进行DNA提取,比较了DNA的提取和保存质量,并对AFLP试验的酶切时间、预扩增产物稀释倍数和选择性扩增引物量等关键因子进行试验和优化。结果表明:4种方法对肌肉组织提取的DNA质量都较好;3种传统方法提取的DNA的保存时间长于试剂盒提取的DNA;使用EcoRⅠ/M seⅠ内切酶组合,10 UEcoRⅠ和2 UM seⅠ分两步各酶切2 h,T4连接酶3 h连接后,以20倍稀释的预扩增产物和5 ng/35 ng的E+3/M+3引物量进行选择性扩增,建立了喙尾琵甲AFLP分子标记体系。
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨清 苏光荣 韩蕾 王正良 孙启祥 彭镇华
用改进的CTAB法,在提取液中加入2%PVP(V/V)和2%β-巯基乙醇,提取到了高质量的基因组DNA,OD260/OD280在1.7～1.9之间,蛋白质、多酚类、色素、RNA等去除较彻底,适于AFLP分析。通过对版纳甜龙竹DNA提取、酶切连接、预扩增、选择性扩增等试验过程中各关键因素的比较研究,建立了优化的AFLP分子标记体系,得到了清晰的AFLP银染指纹图谱,试验结果重复性好。从64对MseI和PstI引物中筛选出8对扩增效果好的引物,利用筛选出8对引物对30份材料进行分析,共扩增出256条多态性带,获得32490个扩增位点,有13289个位点具有多态性,平均每对引物获得4061.25个扩...
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
程丽莉 苏淑钗 秦岭 刘建立 尹伟伦
该文以燕山板栗嫩叶为材料,利用改良的CTAB法提取高质量的总DNA,通过优化了酶切连接、预扩增、选择性扩增等试验条件,得到了清晰的板栗AFLP指纹图谱.研究结果表明①应用经过改良的CTAB法可获得用于构建板栗AFLP体系的高质量DNA;②单独酶切和单独酶连体系比酶切酶连共体系效果更好,确定了板栗基因组DNAAFLP分子标记反应体系;③在所分析的9种引物组合中EAAC+M-CAA、E-AAC+M-CAT和E-AGT+M-CAT3个引物均获得较好的多态性.其中以E-AGT+M-CAT引物对组合的扩增条带信号强度一致性好,条带分布均匀,得到了稳定、清晰、分辨率较高的指纹谱带.
关键词：
板栗 DNA提取 AFLP遗传标记
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