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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
高志参 李照耀 周静 陈婧 周斌
[目的]本试验旨在研究4个种属(猪、人、小鼠、牛)Mx蛋白抗水疱性口炎病毒(VSV)的活性,以揭示胞质定位Mx蛋白抗VSV活性的保守性。[方法]设计特异性引物,PCR扩增4个种属Mx蛋白的全长基因,构建真核表达质粒;PK-15细胞过表达重组质粒,Western blot或间接免疫荧光试验(IFA)检测4个种属Mx蛋白在PK-15细胞内的表达及分布;过表达Mx蛋白的PK-15细胞感染VSV,8或16 h后收样,分别用RT-q PCR、Western blot、IFA和噬斑减少试验来分析VSV的复制。[结果]
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
闭璟珊 杜以军 白娟 姜平
为了探讨脑心肌炎病毒(EMCV)非结构蛋白3C对IFN-β信号通路的影响,采用RT-PCR方法构建EMCV 3C蛋白的重组真核表达质粒pVAX1-3C,将其转染至HeLa细胞,采用间接免疫荧光法(IFA)和Western blot验证其在真核细胞内的表达和分布定位情况;利用Real-time PCR方法检测HeLa细胞表达EMCV 3C蛋白后Ⅰ型干扰素(IFN)效应因子的相对表达量,并用含有双荧光素酶(Luc)报告基因的重组载体检测分析3C蛋白在Ⅰ型IFN信号通路中的作用。结果表明:成功构建pVAX1-3C真核表达质粒,该重组质粒能在HeLa细胞内表达,并分布在细胞核中;pVAX1-3C重组质...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郑增忍 王海霞 龚振华 张彦明 李葳 刘俊辉
针对水疱性口炎病毒(VSV)N基因设计特异性引物,在引物中分别加入EcoR 和Xho 酶切位点。RT-PCR扩增后得到目的基因,将其克隆到表达载体pET30c,连接产物转化于DH5α菌株,在含Kan+的平板上37℃培养24h,然后挑取白色菌落,鉴定为阳性者,转化于BL21菌株,再经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导获得高效表达。表达融合蛋白分子质量为53ku(目的蛋白大约47ku),同预期蛋白大小相近。Westernblot检测表明,其能与本病毒阳性血清发生特异性反应,表达蛋白有望成为有价值的VSV诊断抗原。
关键词：
水疱性口炎病毒 N基因 原核表达载体
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张馨月 章颉 邓凤林 吴建祥
农杆菌共浸润试验结果表明:中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)Y10分离物编码AC4蛋白是RNA沉默抑制子。为了研究RNA沉默抑制子AC4蛋白的作用机制,将TYLCCNV-Y10的AC4基因插入到原核表达载体pET-32a的多克隆位点上,构建重组原核表达载体pET32a-Y10AC4。将重组载体导入BL21(DE3)pLysS进行AC4蛋白表达,并在自然条件下纯化蛋白。利用原核表达的AC4蛋白进行电泳迁移率变动试验(electrophoretic mobilityshift assay,EMSA),分析AC4蛋白分别与单...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王国超 乔军 孟庆玲 刘昱成 杨海波 贺志昊 彭叶龙 谢堃 陈创夫
【目的】分析黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒(CSFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和羊边界病毒(BDV)3种病毒多聚蛋白酶基因密码子的使用特点,初步探讨3种病毒多聚蛋白酶基因的进化及对不同宿主的适应策略。【方法】运用EMBOSS软件的CHIPS和CUSP程序及CodonW在线分子生物学软件,分析CSFV、BVDV和BDV的有效密码子数(ENc),碱基GC含量(Gcall),密码子第1、2、3位GC含量(GC1、GC2、GC3),相对同义密码子使用度(RSCU)及同义密码子第3位的GC含量(GC3s),并对3种病毒多聚蛋白酶基因的ENc进行绘图分析。【结果】CSFV、BVDV、BDV 3种病毒多聚...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
吴磊 袁旭 洪锦璇 陈叶 李训良 宋中宝
为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和马动脉炎病毒(EAV)等动脉炎病毒的Nsp4蛋白在病毒免疫逃逸中的作用，通过免疫沉淀和质谱技术筛选到与Nsp4互作的宿主蛋白mTANK.将pCAGGS-PRRSV-Nsp4-Flag、pCAGGS-EAV-Nsp4-Flag质粒分别与pCAGGS-mTANK-HA质粒共转染HEK293T细胞，发现Nsp4可特异性降解mTANK.为了进一步揭示其中的机制，利用蛋白酶体抑制剂MG-132、凋亡途径抑制剂Z-VAD-FMK、溶酶体抑制剂NH_4Cl和自噬抑制剂3-MA分别处理共转染的细胞，发现这些抑制剂处理并不影响Nsp4对mTANK的降解作用，随后构建了PRRSV Nsp4(E39、E64、E118)和EAV Nsp4(E39、E65、E120)的酶活性突变体质粒.将突变体质粒分别与pCAGGS-mTANK-HA质粒共转染后发现，Nsp4蛋白酶活性缺失后无法降解mTANK.进一步研究发现，mTANK降解产生的片段分别位于30和25～30 ku附近.综上，PRRSV和EAV的Nsp4蛋白可通过其3C样蛋白酶活性特异性切割宿主蛋白mTANK.
[期刊] 中国农业科学
[作者]
林艺华 肖胜华 刘营航 陈建生 傅华英 陈如凯 高三基
【目的】甘蔗黄叶病(yellow leaf,YL)是一种主要的甘蔗病毒病害,在全球多数甘蔗种植国家或地区普遍发生,已对甘蔗生产造成严重威胁。其病原为甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,SCYLV),属于黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属成员。研究SCYLV编码的沉默抑制子P0蛋白的分子特征、保守结构域及其在自然寄主甘蔗上抑制RNA沉默的功能,为下一步从RNA沉默水平解析SCYLV致病分子机理奠定基础。【方法】利用RT-PCR克隆技术获得SCYLV中国分离物CHN-FJ4编码的RNA沉默抑制子基因P0及其两个缺失突变体P0Δ2-15(N端缺失15个氨基酸)和P0Δ155...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
石霖 王秀荣 杨忠苹 陶启蒙 蔡冬冬 武嘉男 王馥梅 田国彬 陈化兰
【目的】研制可同时鉴别检测AI、ND、IB、IBD等4种禽病血清抗体的可视化蛋白芯片。【方法】用超速离心法和蔗糖密度梯度法分别纯化了4种病毒蛋白抗原,调整到合适浓度后点于醛基修饰的片基上,制备蛋白芯片;分别用4种禽病阳性血清杂交,再与金标二抗杂交,银染显色后读取结果,建立4种禽病的可视化蛋白芯片工作平台;进一步对此芯片的特异性以及灰度值与抗体浓度的相关性进行了研究;最后对18个现地血清样品进行了初步应用检测。【结果】结果显示经过条件优化后,芯片检测探针可特异性的相应的抗体进行杂交,呈现较强的杂交信号,且无交叉杂交。信号灰度值在抗体浓度为50～300μg·ml-1范围内成线性关系。用芯片和其它传...
关键词：
可视化 蛋白芯片 禽病 鉴别
[期刊] 中国农业科学
[作者]
金修哲 何雷 程相朝 张春杰 余祖华 韩海锋 杨丹芳 梅京京 李银聚
【目的】为探讨连翘苷等６种中药成分抗猪传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）的作用机制，明确其体外抗病毒作用效果，为抗ＴＧＥＶ的药物筛选提供依据。【方法】利用动物细胞培养技术，采用ＭＴＴ比色法和细胞病变（ＣＰＥ）观察法相结合，测定连翘苷、连翘苷元、绿原酸、咖啡酸、丁香酚、丹皮酚６种中药成分不同浓度下对猪睾丸细胞（ＳＴ）的毒性作用，通过观察细胞ＣＰＥ情况，确定药物对细胞作用的最大安全浓度；同时测定病毒的ＴＣＩＤ＿（５０），用细胞维持液配成１００·ＴＣＩＤ＿（５０）病毒悬液备用；将６种药物在最大安全浓度范围内连续２倍倍比稀释后，分别采用先感染病毒后加药、先加药后感染病毒、药与病毒混合后感染细胞３种不同作用方．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
黄凤兰 雷雪 赵永 李国瑞 罗蕊 陈晓凤 李跃 孙华军
为了获得毒蛋白含量低的蓖麻转基因新材料，以毒蛋白Ａ链基因被共抑制的转基因蓖麻植株的Ｔ０、Ｔ１、Ｔ２种子为研究对象，对种子中的毒蛋白含量进行测定。结果表明，采用磷酸盐提取法、ＢＣＡ试剂盒、ＵＶｗｉｎ５紫外软件Ｖ５．１．０、ＢＡｎｄ ＳＣＡｎ蛋白定量分析软件相结合的方法，测定种子中毒蛋白含量，获得了２个共抑制后稳定遗传的材料，即Ｔ２－９－１、Ｔ２－１５，毒蛋白Ａ链含量均为０，毒蛋白Ｂ链含量分别为对照通蓖５号的７７．６３％，８３．３８％。这２个材料可以作为低毒蛋白含量的蓖麻材料进行推广。
关键词：
蓖麻 毒蛋白 A链基因
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘学芹 曹胜波 李么明 孙敏轩 叶静 周锐 杨影 徐高原 陈焕春
以JEV的NS1基因mRNA为靶序列,设计合成了4个siRNA序列,构建了各自的表达质粒pS-NS1A、pS-NS1B、pS-NS1C和pS-NS1D。通过间接免疫荧光、Western blot检测、RT-PCR和病毒空斑检测等方法对这些siRNAs抑制JEV复制的效果进行了评价。结果表明4个siRNA表达质粒均对JEV在细胞中的复制具有不同程度的抑制作用,其中pS-NS1C、pS-NS1D有显著的抑制作用。说明针对NS1基因的siRNAs可以有效抑制JEV的复制,并有望成为应对JEV感染的治疗方法。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
于天飞 董慧莹 谢鹏宇 孙婉姝 尹海畅 黎明 于志丹
【目的】原核表达猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)spike蛋白亲和肽(SQHT),检测其病毒亲和性,为建立TGEV诊断方法奠定理论和物质基础。【方法】人工合成TGEV spike蛋白亲和肽基因,亚克隆后将该基因分别插入至原核表达载体pET-32a和pGEX-6p-1中,构建重组质粒pET-32a-SQHT和pGEX-6p-SQHT,对重组质粒进行BamHⅠ单酶切和BamHⅠ/XhoⅠ双酶切及测序鉴定。将重组质粒分别转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),用IPTG进行诱导表达,对其表达产物的生物学活性进行检测。【结果】亚克隆获得了150 bp的TGEV spike蛋白亲和肽基因。成功构建了重组质粒pET-32a-SQHT和pGEX-6p-SQHT,并诱导表达出重组蛋白TRX-SQHT和GST-SQHT,其分子质量分别为25和31 ku。Western blot分析表明,2种重组蛋白与TGEV病毒粒子具有良好的亲和性;Dot-ELISA分析表明,2种重组蛋白与TGEV病毒粒子的最低结合滴度TCID_(50)为5×10~2 mL~(-1)。特异性试验表明,重组蛋白TRX-SQHT和GST-SQHT均可与TGEV产生特异性结合,而不与猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒(PoRV)结合。【结论】使用原核细胞成功表达了TGEV spike蛋白亲和肽,表达的重组蛋白具有很好的TGEV特异亲和性。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
丁国伟 李琛 李玉安 叶正琴 宋庆庆
为研制检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的试剂盒,对IBRV gD蛋白主要功能域的表达及免疫原性进行研究。根据NCBI数据库录入的1型牛疱疹病毒(bovine herpesvirus type 1)gD蛋白序列(Gen Bank登录号为NC_001847)设计引物,用PCR扩增gD基因类免疫球蛋白结构域,构建原核表达载体pET32a–Δg D,转化大肠杆菌Rosseta(DE3)感受态细胞,并诱导重组蛋白表达。经SDS–PAGE分析,获得了相对分子质量约43 000的目的蛋白,该蛋白的相对分子质量与gD
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
彭树英 吕宁 何晓宁 张涌
采用RT-PCR和重组PCR扩增猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)TSX毒株纤突蛋白(spike protein,S)基因全长cDNA序列,分离纯化PCR产物,连接到pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆pGEM-S,并对其进行酶切鉴定和测序,对测序结果及推导氨基酸序列进行同源性分析。结果表明,S基因全长为4 350 bp(GenBank登录号DQ001167),编码1 449个氨基酸,N端前16个氨基酸为推测的信号肽序列,其后1 433个氨基酸构成成熟蛋白;与GenBank中已发表的9个TGE...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李华 杨汉春
利用反转录一套式聚合酶链式反应技术从北京地区禽传染性支气管炎病毒(IBV)分离株 BJ_1、BJ_2、BJ_3株中成功扩增出1054bp 纤突蛋白高变区。利用限制性内切酶 Sin Ⅰ和 Pst Ⅰ的酶切分析证实了RT-nested PCR 的特异性,结合计算机酶切位点分析图谱进行理论 RFLP 分析。将三段 S_1基因分别克隆到pUC19质粒中,获得重组质粒 pUC IBV S_1-BJ_1、pUC IBV S_1-BJ_2、pUC IBV S_1-BJ_3。利用双脱氧链终止法对三个重组质粒进行双向测序,获得三株分离株 S_1基因高变区的序列。将得到的三个序列与标准株 M_(41),Beaud...
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