【目的】建立可同时检测李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)、李矮缩病毒(Prune dwarf virus,PDV)、樱桃小果病毒2(Little cherry virus-2,LChV-2)的多重RT-PCR检测方法。【方法】以复合感染3种病毒的甜樱桃病株叶片为材料,采用CTAB法提取样本总RNA,选用随机六聚体引物对植物样本总RNA进行反转录,所得cDNA作为多重RT-PCR的扩增模板。根据GenBank中PNRSV、PDV、LChV-2基因组序列共设计6对特异引物,分别通过单一RT-PCR和多重RT-PCR筛选出可用于同时检测3种甜...

介绍了一种从木本植物组织中获得高质量RNA的快速、简单和高效的核酸提取方法。该方法是基于核酸的二氧化硅捕获,避免了使用苯酚、氯仿等有机溶剂。利用该方法从樱桃组织中提取的总RNA用RT-PCR技术检测PDV,PNRSV均获得成功。从感病植株的一年生枝的叶片、韧皮部及芽组织中扩增出了预期的目的片段,即172和449bp,而健康组织中无此扩增带。该法提取的总RNA用于RT-PCR技术检测,其敏感性至少与商业出售的QiagenRNeasy提取试剂盒相当,但简单经济。

【目的】建立3种大白菜病毒病多重RT-PCR检测技术,为病毒病快速检测、白菜病毒病防治与抗病育种提供参考。【方法】针对我国大白菜芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)3种病毒的外壳蛋白(CP)基因保守区序列,设计特异性检测引物,从多重RT-PCR(mRT-PCR)扩增引物、Mg(2+)浓度、Taq DNA聚合酶及dNTPs浓度、退火温度、延伸时间和

根据黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)和烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物对,运用单重RT-PCR检测到病毒并筛选出适合多重RT-PCR的引物对。以唐菖蒲18S rRNA为内参照,建立同时检测CMV和TMV的多重RT-PCR方法。此方法可从带病样品中扩增出CMV(629bp)和TMV(423bp)2条特异片段。测序结果表明:CMV扩增产物与其他植物分离物核苷酸的同源性为93%～97%,TMV扩增产物与其他分离物核苷酸的同源性可达99%。

针对甘薯生产上发生为害严重的甘薯RNA病毒—甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)、甘薯G病毒(SPVG)和甘薯C病毒(SPVC),建立了多重RT-PCR检测方法。首先根据GenBank中收录的这些病毒的外壳蛋白(CP)基因的保守序列，利用Premier 5.0软件分别设计并合成了上述4种病毒的特异性引物；以4种病毒的下游特异性引物合成的cDNA为模板，在同一体系中同时加入上述4种甘薯病毒引物进行PCR扩增，初步建立这4种甘薯RNA病毒的最佳多重RT-PCR体系；通过对该多重RT-PCR体系的退火温度、延伸时间、dNTPs量、模板量、引物浓度等条件的优化，建立了能够同时检测这4种甘薯RNA病毒的最优四重RT-PCR检测体系，并对优化的多重RT-PCR体系进行了挑战测试和灵敏度测试。试验结果显示，优化的多重RT-PCR体系，各病毒引物之间不会出现交叉干扰，所扩增的4条目的条带清晰，能够明确区分上述4种甘薯病毒；挑战检测和灵敏度测试显示，此检测体系特异性强且灵敏度高。所建立的上述4种甘薯RNA病毒的多重RT-PCR检测方法能同时检测4种甘薯病毒，不仅准确灵敏，而且降低了检测成本，提高了病毒检测效率。

根据多重RT-PCR的技术原理,利用对虾传染性表皮与造血组织坏死症病毒、白斑综合征病毒、黄头病毒和桃拉综合征病毒的基因序列分别设计了4对特异引物,建立多重RT-PCR体系用于虾4种病毒的检测。多重RT-PCR体系能特异地扩增出IHHNV、WSSV、YHV和TSV的目的片段:TSV特异性扩增片段508 bp,WSSV特异性扩增片段435 bp,IHHNV特异性扩增片段301 bp和YHV。特异性扩增片段614 bp。结果表明,多重PCR虾病毒检测系统具有较高的特异性和敏感性,并对其它对虾病原呈阴性。IHHNV、TSV、WSSV和YHV模板在多重PCR虾病毒检测体系中的检测下限分别为0.1,1,0...

通过对Genbank登录的CSFV、PRRSV和JEV的核苷酸序列进行比对分析,找出CSFV的E2基因,PRRSV的Nsp2基因和JEV的E基因为相对保守区域[1]。利用生物学软件在保守序列分别设计一对引物,通过对PCR反应条件的优化,确定了最佳引物浓度、最佳Mg2+浓度和最佳退火温度,建立了多重二温式PCR方法检测CSFV、PRRSV和JEV。其扩增的目的片断大小分别为CSFV(482 bp)、PRRSV(576 bp)和JEV(375 bp),将传统三温式PCR过程中的退火与延伸合并为一步,从而大大节省临床检测时间,同时又能通过一个反应体系对CSFV、PRRSV及JEV三种猪主要RNA病毒...

[目的]建立乐都紫皮大蒜4种病毒的多重RT-PCR快速检测方法,为大蒜病毒病病原鉴定、脱毒效果验证等提供技术支撑。[方法]根据乐都紫皮大蒜RNA全长转录组测序结果,分别设计洋葱黄矮病毒(onion yellow dwarf virus,OYDV)、大蒜潜隐病毒(garlic latent virus,GLV)、大蒜D病毒(garlic virus D,GarVD)和大蒜X病毒(garlic virus X,GarVX)4种病毒的外壳蛋白特异性引物,筛选不同引物,优化引物用量、模板用量、退火温度等条件,并进行了多重RT-PCR的灵敏度检测和12份引进栽培大蒜种质资源的病毒检测。[结果]通过优化筛选,在一个PCR反应体系中实现了OYDV(1 232 bp)、GLV(831 bp)、GarVD(506 bp)和GarVX(116 bp)4种病毒的多重检测,最优反应条件为退火温度55℃,模板用量2.5μL,混合引物用量各1.0μL。多重RT-PCR的灵敏度略低于单一RTPCR。对引进的12份栽培大蒜资源进行4种病毒的多重RT-PCR检测发现,有5份资源存在4种病毒,4份资源存在2种病毒,3份资源存在1种病毒。对7份资源中经多重PCR未检测到的病毒,使用单一RT-PCR进行检测和验证发现,除1份内蒙古资源(NMG)的1种病毒(GarVX)外,多重RT-PCR结果与单一RT-PCR检测结果一致。[结论]本研究建立的大蒜多重RT-PCR体系可靠性强,可用于大蒜病毒的检测与防控。

病毒检测在预防和控制对虾病毒性疫病实践中具有重要的作用和意义。为了提高对虾病毒检测的快速性和简便性,建立了一种可同时检测6种对虾病毒的RT-PCR方法,并利用该方法对来自广西沿海地区的130份病虾样品中的黄头病毒(YHV)、白斑综合征病毒(W SSV)、桃拉病毒(TSV)、肝胰腺坏死病毒(HPV)、传染性皮下组织坏死病毒(IHHNV)以及杆状病毒(MBV)进行了检测。检测结果:白斑综合征病毒发病率最高,检出率高达73.8%;传染性皮下组织坏死病毒发病率为18.5%;桃拉病毒检出率为3.1%;未检出黄头病毒、肝胰腺坏死病毒和杆状病毒。该RT-PCR方法扩增得到的片段经测序,结果与标准毒株的核酸数...

为了快速提取植物叶片的总RNA,并对烟草病毒进行检测,对提取及检测方法进行了研究。结果表明:以黄瓜叶片、白肋烟叶片为试材,用TRIzol试剂盒在1 h内提取到纯度高、完整性好的总RNA。设计烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒的特异性引物,RT-PCR检测,从感病叶片中分别扩增出313,326,392 bp的目的片断,而健康叶片中无此扩增带。构建这3种病毒重组质粒,对核苷酸序列与GeneBank中报道的进行比较,同源性分别为99.36%,97.55%,98.21%。用这种方法快速、可靠,为烟草病毒的检测提供科学依据。

根据GenBank中登录的鱼类神经坏死病毒CP基因序列,选择高度保守区域设计引物和TaqMan荧光探针,通过对实时荧光RT-PCR反应条件进行优化,建立了用于检测鱼类神经坏死病毒的实时荧光RT-PCR方法。利用该方法检测鱼类神经坏死病毒及其他多种常见的水生动物RNA病毒,结果只能检测到目的病毒,表明其具有良好的特异性。灵敏性试验发现,其最低检测限可达1.2pg/μL的总RNA。与RT-PCR的灵敏度对比试验表明,其敏感度比RT-PCR高100倍。对同一样品进行检测,在组内及组间的变异系数分别为0.9%以及1.5%,证实其重复性极好,并且从抽提核酸到得出结果仅需4h。对临床500份样品进行鱼类神...

【目的】猪Ｄｅｌｔａ冠状病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｄｅｌｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ，ＰＤｃｏｖ）是近年来新发现的可引起猪只，特别是新生仔猪腹泻的冠状病毒，其引发的腹泻具有较高的发病率和死亡率，是造成新生仔猪死亡的重要原因之一。试验拟建立新现ＰＤｃｏｖ ｒｔ－Ｐｃｒ检测方法，并调查当前江西腹泻猪群中ＰＤｃｏｖ的感染情况。【方法】通过对Ｇｅｎ Ｂａｎｋ数据库中ＰＤｃｏｖ全基因组序列的比对分析，找出保守序列，用Ｐｒｉｍｅｒ ３．０在线软件设计１对扩增ＰＤｃｏｖ核衣壳（ｎ）蛋白基因片段的特异性引物，基于该引物建立ＰＤｃｏｖ ｒｔ－Ｐｃｒ检测方法；用建立的方法检测腹泻猪粪便及肠道样品，挑选阳性扩增产物进行克．．．

罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus,MrNV)是世界动物卫生组织规定必需上报的罗氏沼虾白尾病(whitetail disease,WTD)的主要病原体。为建立快速检测MrNV的套式RT-PCR方法,根据GenBank上发表的MrNV衣壳蛋白基因序列设计2对特异性引物,对PCR条件进行优化后通过特异性试验和敏感性试验检测其特异性和敏感性。结果表明:该方法能特异性地扩增出205 bp的MrNV衣壳蛋白基因片段,最佳引物浓度为0.8μmol/L、退火温度为56℃、Mg2+浓度为2.0 mmol/L,而对其他对虾病毒基因组均没有扩增出条带;检测Mr...

为建立猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ）变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株快速鉴别检测方法，根据ＧＥｎ Ｂａｎｋ中公布的ＰＥＤＶ变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株的Ｓ基因和ＯＲＦ３基因，设计合成２对特异性扩增引物，用以扩增ＰＥＤＶ Ｓ基因和ＯＲＦ３基因，通过目的片段的数量和片段大小来判断ＰＥＤＶ的毒株类型；通过对退火温度等反应条件的优化，建立了检测不同ＰＥＤＶ毒株类型的多重ＲＴ－ＰＣＲ鉴别检测方法。结果显示，所建立的多重ＲＴ－ＰＣＲ鉴别检测方法能特异性区分ＰＥＤＶ变异毒株、经典毒株和弱毒疫苗株；ＰＥＤＶ变异毒株扩增出２条目的条带，分别为２３４ ＢＰ的ＯＲＦ３基因片段和８２６ ＢＰ的Ｓ基因片段；ＰＥＤＶ经典毒．．．

【目的】建立一种可同时检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）野毒株、猪A群轮状病毒（GARV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）、猪阿尔法冠状病毒（SADS-CoV）及猪捷申病毒（PTV）5种猪腹泻病毒的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测法。为猪腹泻病的快速诊断和流行病学调查提供高效灵敏的工具。【方法】对PEDV多个基因型毒株ORF3基因比对分析，以PEDV野毒株为模板，对疫苗株ORF3基因稳定缺失区域设计特异性探针，并在两端保守区域设计上下游引物；在靠近GARV G3、G4、G5和G9型NSP5基因5′端保守碱基区域设计引物及探针，并加入简并碱基。同时，分别选择PDCoV M基因、PTV 5′UTR序列、SADS-CoV N基因等保守基因设计特异性引物及探针，用于多重荧光定量PCR方法的建立。对引物、探针浓度和退火温度进行优化；用RStudio参照代码绘制ROC曲线，确定检测方法的敏感度值、特异度值及曲线下面积AUC，并计算Youden指数，最终确定检测临界值；从阳性核酸中扩增靶基因，并克隆至pEASY-T1载体。通过体外转录，获得5种标准品分别命名为：cRNA-PEDV、cRNA-GARV、cRNA-PDCoV、cRNA-PTV和cRNA-SADS-CoV。对检测方法的敏感性、特异性和重复性等进行评估；并与同类方法对临床样本的检测符合率进行比较。【结果】得到了5种病原检测的最佳引物、探针浓度和最佳退火温度。根据ROC曲线确定PEDV、GARV、PDCoV、PTV和SADS-CoV临界CT值分别为：35.78、34.25、34.98、34.60和35.70;5种病原的检测下限均可达到1×102 copies/μL，标准曲线线性关系良好，扩增效率在96.3%—104%之间；该方法对PEDV CV777疫苗株、PEDV AJ1102疫苗株、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪霍乱沙门氏菌（S.choleraesuis）、多杀性巴氏杆菌（P.multocida）、大肠杆菌（E.coli）、猪链球菌（S.suis）和葡萄球菌（S.aureus）等多种菌毒株均不检出，具有良好的特异性；经重复性检验，组内变异系数在0.22%—3.08%之间，组间变异系数在0.89%—4.0%之间；对242份临床样本检测并与同类方法的检测结果进行比较，符合率分别为：PEDV 97.9%、GARV 98.8%、PDCoV 100%、PTV98.3%和SADS-CoV100%,Kappa值均大于0.9。对PEDV野毒株的检测准确性高于同类方法。此外，对临床样本检测结果显示，当前四川省腹泻猪群中尚无SADS-COV检出；但PEDV、GARV、PDCoV和PTV仍持续流行，其总体阳性率分别达到：10.7%(26/242)、13.6%(33/242)、18.2%(44/242)和14.5%(35/242)，且各腹泻病原之间存在不同形式和程度的混合感染，使感染猪腹泻病情加剧。故需进一步加强几种猪腹泻病毒在本地区猪群中流行情况调查和遗传变异规律研究，为制定更具针对性的防控措施提供依据。【结论】本研究成功建立了一种同时检测PEDV野毒、PDCoV、SADS-CoV和GARV、PTV多基因型的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR，为猪腹泻病的快速鉴别诊断和流行病学调查提供了一种高效灵敏的工具。