根据目前水产上常见病原菌鳗弧菌Vibrio anguillarum、嗜水气单胞菌Aeromonas hy-drophila、迟缓爱德华氏菌Edwardsiellatarda的毒力相关基因,选择具有特异性的鳗弧菌调控毒力蛋白表达的toxR(Positive transcriptional regulator)基因、嗜水气单胞菌中重要的编码气溶素(Aero-lysin)基因aerA、迟缓爱德华氏菌中编码分泌系统装置蛋白的基因evpA,分别设计1对特异性引物,建立可同时特异性地检测3种菌的多重PCR检测体系。对反应条件进行优化并测试了其特异性和灵敏度。实际样品检测证明,此多重PCR体系具有良好的可靠...

【目的】建立可同时快速检测斑点叉尾鮰败血症３种病原（嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌）的多重ＰＣＲ检测方法。【方法】根据嗜水气单胞菌溶血素基因（Ｈｌｙ）、维氏气单胞菌脱氧核糖核酸酶Ⅰ基因（ＤＮａｓｅⅠ）以及鮰爱德华菌溶血活化基因（ｅＨａ）的保守序列，设计３对特异性引物，优化并建立斑点叉尾鮰败血症３种主要病原菌的多重ＰＣＲ方法，对其特异性和灵敏度进行考察，并将其用于临床样品的检测。【结果】建立的多重ＰＣＲ方法，当Ｈｌｙ基因、ＤＮａｓｅⅠ基因以及ｅＨａ基因的引物浓度分别为１．０，１．０和０．５μｍｏｌ／ｌ，退火温度为５９．５℃时，各目的片段均可较好地扩增。特异性试验结果表明，建立的多重ＰＣＲ．．．

根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc、沙门氏菌的侵袭蛋白基因invA、志贺氏菌的侵染性质粒抗原H基因ipaH和副溶血性弧菌的毒力表达调控基因toxR设计引物,建立一种快速检测水产品中上述4种常见食源性致病菌的多重PCR方法。结果显示,沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌及副溶血性弧菌的多重PCR扩增片段产物大小分别为549、426、348和243 bp,该检测方法具有良好的特异性和灵敏度。设计优化了可用于水产样品中4种目标致病菌的共增菌培养基,该方法应用于35份实际水产样品的检测,并与国标方法对比验证,4种致病菌的整体符合率达94%以上,两种检测方法无显著性差异(P>0.05)。可见,该多重...

【目的】建立在扩增内标存在下同时快速检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌4种食源性致病菌的五重PCR方法。【方法】以细菌16S rRNA基因为扩增内标靶序列,针对溶藻弧菌gyrB基因、副溶血弧菌collagenase基因、创伤弧菌vvhA基因、霍乱弧菌ompW基因,分别设计特异性引物,建立多重PCR体系,对其灵敏度和特异性进行评价,并将建立的五重PCR应用于弧菌的筛选。【结果】建立的多重PCR检测体系对混合模板中副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌的灵敏度达10 CFU/mL,霍乱弧菌的灵敏度达105CFU/mL,经特异性评价证实其特异性好,并能有效指示PCR反应的假阴性,将建立的多重PCR...

本研究建立一种同时特异性地检测5种常见食源性致病菌的多重PCR方法。根据目前食品中常见病原菌副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、单核细胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes、肠炎沙门氏菌Salmonella enteritidis、福氏志贺氏菌Shigella flexneri的相关毒力基因,选择具有特异性的副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因、单核细胞增生性李斯特菌编码溶血素O基因、沙门氏菌侵袭蛋白A基因及志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因,设计5对特异性引物进行多重PCR...

【目的】针对生产中危害严重的3种蔬菜土传病原菌瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae),建立三重PCR(triplex PCR)检测体系,为蔬菜土传真菌病害的早期诊断和鉴定提供技术与方法。【方法】筛选3种病原菌特异性引物组合,通过设定不同的PCR退火温度、引物浓度、循环次数以及延伸时间,探索影响三重PCR扩增的因素,建立蔬菜土传病原菌三重PCR检测体系,并对体系灵敏度进行检测。为了验证建立体系的稳定性,选择2×Taq Master PCR Mix(北京博迈德生物技术有限公司)和TaKaRa Taq酶(大连宝生物工程有限公司)2个不同公司的试剂,分别利用C1000 Touch~(TM)型(赛默飞世尔科技有限公司)与Aeris~(TM)型(新加坡艺思高科技有限公司)热循环仪进行三重PCR反应,比较检测结果的可重复性。对田间采集的35份病害样本和149份土壤样本,分别进行三重PCR和病原菌分离检测,以确定所建立得三重PCR检测体系的适用性。【结果】三重PCR反应体系中引物对AsAPH2B/AsPyF、FOF1/FOR1、VActF/VActR可分别扩增出瓜果腐霉、尖镰孢、大丽轮枝菌长度为163、328和530 bp的特异性目的片段。反应体系(25μL):0.12μmol·L~(-1) AsAPH2B/AsPyF,0.16μmol·L~(-1) FOF1/FOR1,0.24μmol·L~(-1) VActF/VActR,2×Taq Master PCR Mix 12.5μL,退火温度为60.8℃,35个循环。该体系对病原菌纯培养物的检测灵敏度为10~(-1) ng·μL~(-1),对土壤中大丽轮枝菌、尖镰孢和瓜果腐霉的检测灵敏度分别为10~5、10~6个孢子/g土壤和10~(-2) mg菌丝/g土壤。分别采用2×Taq Master PCR Mix和TaKaRa Taq酶,利用C1000 Touch~(TM)型和Aeris~(TM)型热循环仪进行三重PCR,扩增结果一致,说明三重PCR体系检测稳定性好。对田间采集的病害和土壤样本进行检测,25份病害样本和71份土壤样本中检测出带菌,三重PCR检测与病原菌分离培养结果一致。【结论】本研究建立的瓜果腐霉、尖镰孢、大丽轮枝菌三重PCR检测体系具有灵敏度高、稳定性和重复性好的特点,能够快速、准确地检测田间病株及其根围土壤中的瓜果腐霉、尖镰孢、大丽轮枝菌,为蔬菜土传病害的早期预防和流行监测提供了有效的技术手段。

应用聚合酶链式反应(PCR)方法对福建、广东和海南等地沿海的养殖牡蛎进行包拉米虫、派琴虫和单孢子虫检测.结果表明,这些地区的牡蛎均不同程度地感染这些原虫,经鉴定病原为牡蛎包拉米虫、奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫.根据基因库中奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫的基因序列设计多对特异性引物,检测包拉米虫的引物采用世界动物卫生组织推荐引物,通过对多重PCR反应条件的优化,建立可同时检测这3种原虫的多重PCR方法.运用该方法对样品中的牡蛎包拉米虫、奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫进行扩增,结果得到与试验设计相符的303、480和749 bp 3条特异性扩增条带,对其他贝类病原核酸的扩增均为阴性.多重PCR方法最低能检测...

本研究检测了分离自发病大菱鲆、半滑舌鳎及鲤鱼的22株病原鳗弧菌(Vibrio anguillarum)毒力相关基因的携带情况,并建立了病原鳗弧菌的分子生物学检测方法。以PCR方法检测8个毒力相关基因的分布,结果显示,22株病原鳗弧菌均可扩增出6个基因(emp A、vah1、vah4、fla A、rtx A和ton B)目的条带,未扩增出vir A和ang M基因;针对vah4和rtx A设计引物进行双重PCR扩增,同一PCR反应体系可扩增出两条目的条带,灵敏度为2.4×103 CFU/ml,对照菌无任何扩增条带;以vah4设计引物进行LAMP扩增,病原鳗弧菌可扩增出阶梯状条带,呈现阳性反应,6...

本研究检测了分离自发病大菱鲆、半滑舌鳎及鲤鱼的２２株病原鳗弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）毒力相关基因的携带情况，并建立了病原鳗弧菌的分子生物学检测方法。以ＰＣｒ方法检测８个毒力相关基因的分布，结果显示，２２株病原鳗弧菌均可扩增出６个基因（ｅｍＰａ、Ｖａｈ１、Ｖａｈ４、ｆｌａａ、ｒｔｘａ和ｔｏｎｂ）目的条带，未扩增出Ｖｉｒａ和ａｎｇｍ基因；针对Ｖａｈ４和ｒｔｘａ设计引物进行双重ＰＣｒ扩增，同一ＰＣｒ反应体系可扩增出两条目的条带，灵敏度为２．４×１０３ Ｃｆｕ／ｍｌ，对照菌无任何扩增条带；以Ｖａｈ４设计引物进行ｌａｍＰ扩增，病原鳗弧菌可扩增出阶梯状条带，呈现阳性反应，６株对照菌无阶梯．．．

本研究针对养殖对虾6种病毒,包括白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、肝胰腺细小病毒(HPV)、桃拉综合征病毒(TSV)、对虾杆状病毒(BP)和传染性肌肉坏死病毒(IMNV),选择各自的基因分别设计特异性引物和探针,首先进行了单一病毒的PCR验证,在此基础上建立了同时特异性检测6种对虾病毒的多重PCR检测体系。对反应条件进行优化并进行特异性和灵敏度的验证。50μl反应体系,Mg2+的最佳浓度为5mmol/L,ExTaq酶最佳用量为3.75U,反应程序中最佳退火温度为55.5℃。6种病毒之间以及与对虾基因组都存在很好的特异性。最终经试验验证,该系统的检测灵敏度对...

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是浙江省养殖大黄鱼(Pseudnosciaena crocea)弧菌病的主要致病菌。本研究选择针对溶藻弧菌和副溶血弧菌的胶原酶基因,哈维氏弧菌的部分ToxR基因的特异性,优化设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,建立了一种检测致病性弧菌的多重PCR检测方法。经过琼脂糖凝胶电泳后的条带分析判断,可以在一个PCR管中同时成功地检测这3种病原细菌,含溶藻弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌3...

【目的】建立可同时检测李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)、李矮缩病毒(Prune dwarf virus,PDV)、樱桃小果病毒2(Little cherry virus-2,LChV-2)的多重RT-PCR检测方法。【方法】以复合感染3种病毒的甜樱桃病株叶片为材料,采用CTAB法提取样本总RNA,选用随机六聚体引物对植物样本总RNA进行反转录,所得cDNA作为多重RT-PCR的扩增模板。根据GenBank中PNRSV、PDV、LChV-2基因组序列共设计6对特异引物,分别通过单一RT-PCR和多重RT-PCR筛选出可用于同时检测3种甜...

【目的】建立3种大白菜病毒病多重RT-PCR检测技术,为病毒病快速检测、白菜病毒病防治与抗病育种提供参考。【方法】针对我国大白菜芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)3种病毒的外壳蛋白(CP)基因保守区序列,设计特异性检测引物,从多重RT-PCR(mRT-PCR)扩增引物、Mg(2+)浓度、Taq DNA聚合酶及dNTPs浓度、退火温度、延伸时间和

【目的】建立快速检测奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌3种食源性致病菌的多重PCR方法。【方法】根据奇异变形杆菌尿素酶合成的正向调节因子R基因(ureR)、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因(invA)和单核细胞增生李斯特氏杆菌编码溶血素O(LLO)的hlyA基因,分别设计3对特异性引物,对单基因PCR和单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及建立L16(43)正交试验对单管多重PCR扩增条件,如引物浓度、Tm值、模板量等的优化,建立快速检测奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌的稳定的单管多重PCR方法。【结果】针对奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌3种食源性...

【目的】建立致病性猪链球菌种及其1、2、7型的快速多重PCR检测方法,并进行初步的临床应用。【方法】根据猪链球菌种特异的gdh基因序列及其1(14)、2(1/2)、7型特异的cps1I、cps2H、cps7H基因序列,分别设计4对引物,通过对单个基因PCR和多重PCR扩增条件、反应体系的优化,建立了快速检测猪链球菌种及其1(14)、2(1/2)、7型的4重PCR方法。利用保存的猪链球菌不同血清型菌株和其他相关标准菌株作为参考菌株,对建立的多重PCR方法进行特异性和敏感性试验。用所建立的4重PCR方法对河南省不同地市的39份猪扁桃体样品进行检测,并选取部分样品的PCR产物进行测序验证。【结果】所...