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[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
张扬 黄维峰 周菲 林拥军
基于Golden Gate载体构建过程,对CRISPR/Cas9双靶点敲除技术的载体构建系统进行了优化,建立了一种简单快速高效且无PCR扩增的双靶点CRISPR/Cas9载体构建方法。在本方法中,只需将设计好的2个靶点DNA小片段和1个外源片段用T4DNA连接酶构建到CRISPR/Cas9载体上即可。用本方法对10个已报道的水稻基因构建了20个双靶点CRISPR/Cas9载体,阳性率为100%,测序结果显示无突变。该载体系统非常适合大批量CRISPR/Cas9载体的构建,同时也为其他植物中构建双靶点CRISPR/Cas9载体提供借鉴。
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵恒 张宏 廖芳丽 李刚 赵福永
基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术是一种新兴的分子修饰工具,可实现基因组特定位点碱基的缺失、插入或替换,造成基因功能丧失,现已广泛应用于基因功能的研究。为深入探讨甘蓝型油菜中Bn SVP的生物学功能,以中双11号基因组(甘蓝型油菜参考基因组,v4.1)中的4个Bn SVP为靶标基因,并针对不同染色体上的Bn SVP基因,应用CRISPR-P 2.0软件共设计了12条特异sg RNA种子序列,以实现4个Bn SVP同源基因的全部或部分敲除;以p YLCRISPR-Cas9P35S-H为基本载体,以At U3b或At U3d为sg RNA转录启动子,采用Golden gate cloning技术分别组装构建了6个双靶点CRISPR/Cas9植物表达载体。测序结果表明,6个CRISPR/Cas9植物表达载体各sg RNA表达盒DNA序列正确,双靶点组装顺序无误。研究结果为进一步原生质体瞬时表达和农杆菌介导的油菜遗传转化奠定了基础,同时也为应用CRISPR/Cas9基因组编辑系统研究植物多拷贝同源基因的功能提供参考。
[期刊] 华北农学报
[作者]
白璐 辛翠花 刘乐乐 王俊杰 简磊 邵玉涛 裴海霞 郭江波
为了研究本氏烟草NbEHD1基因的生物学功能，采用生物信息学方法对其基因结构、蛋白保守结构域、磷酸化位点、亚细胞定位及进化关系等多个方面进行预测。结果表明，本氏烟草NbEHD1编码序列全长1 638 bp,其基因组序列包含16个外显子和15个内含子。NbEHD1蛋白大概率定位于细胞质中，无信号肽，无跨膜区，蛋白序列有42个磷酸化位点。NbEHD1属于P-loop＿NTPase超家族，具有EHD家族特有保守结构域。系统进化关系结果表明，本氏烟草NbEHD1与马铃薯、番茄的EHD序列亲缘关系较近。经与SGN数据库中本氏烟草测序数据比对，获得NbEHD1预测的全序列并设计基因特异性引物，扩增得到其序列全长。在获得NbEHD1 CRISPR/Cas9基因编辑载体后，采用农杆菌介导的方法，将此载体成功转化到本氏烟草叶片，经鉴定成功获得T_0阳性植株16株，为进一步确定NbEHD1基因的生物学功能提供了研究材料。
[期刊] 华北农学报
[作者]
宋平丽 李刚 许建锋 马青翠 亓宝秀 张玉星
为明确杜梨赤霉素受体GID1(Gibberellin insensitive dwarf 1)的生物学功能,以杜梨为试材,通过同源克隆方法得到PbGID1s基因,利用生物信息学分析软件构建基因结构并设计靶位点;利用酶切-连接方法将带有靶点的sgRNA表达盒构建至CRISPR/Cas9表达载体上;通过农杆菌介导方法,将CRISPR/Cas9表达载体转化至杜梨子叶中。结果表明,在杜梨基因组中克隆得到4个PbGID1s,分别命名为PbGID1b-1、PbGID1b-2、PbGID1c-1、PbGID1c-2,基因结构分析显示该家族基因均由2个外显子和1个内含子组成;氨基酸序列比对发现PbGID1s均具有GID1家族所特有的HGG和GXSXG保守结构域;将含有5个靶位点的sgRNA表达盒成功构建至pYLCRISPR/Cas9P_(35S)-N植物表达载体上,可同时对该家族4个基因进行编辑;杜梨遗传转化试验结果表明,共计浸染595粒杜梨子叶,获得抗性芽176个,阳性植株33株,转化效率达到5.55%。成功构建了可以同时靶向杜梨PbGID1s家族基因的CRISPR/Cas9载体,通过农杆菌介导,成功将该载体转化至杜梨子叶,并获得阳性植株,为杜梨遗传转化和基因编辑创建矮生突变体研究提供了重要参考。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
史奇奇 李增强 韦范 汤丹峰 贾瑞星 谢红英 周瑞阳 陈鹏
为探明miRNA在红麻中的功能,以红麻基因组DNA为模板,根据红麻microRNA(miRNA)高通量测序数据结果,克隆红麻miR394前体基因序列,并构建CRISPR/Cas9载体。结果表明红麻miR394前体基因序列大小为175bp,用Mfold在线软件分析,其前体序列能形成稳定的二级结构。根据红麻miR394前体基因序列,设计合适的CRISPR/Cas9靶标序列,利用改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统,以AtU3b和AtU6-29质粒为模板,使用Overlapping PCR法构建AtU3b-sgRNA和AtU6-29-sgRNA表达盒,使用Golden Gate Cloning方法成功把靶标AtU3b-sgRNA和AtU6-29-sgRNA表达盒构建到pYLCRISPR/Cas9载体中,并将构建好的载体命名为pCas9-miR394。分离红麻叶片原生质体,将pCas9-miR394载体转入红麻叶片原生质体中进行瞬时表达,测序结果表明:2个靶点Target site 1(T1)和Target site 2(T2)处都发生碱基突变,表明pCas9-miR394载体在红麻原生质体中具有靶向切割的活性。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
李东昊 姜玲 刘春林 阮颖
以甘蓝型油菜‘湘油15号’为试材,通过生物信息学分析,运用CRISPR/Cas9系统对Bna SDG8第1个外显子上的Bna SDG8–A和Bna SDG8–C保守序列区域进行CRISPR/Cas9敲除位点设计,构建了CRISPR/Cas9敲除载体p CAMBIA1300–sg RNA/Cas9–Bna SDG8;通过遗传转化,获得转化植株19株;经测序比对,4株植株的Bna SDG8被成功编辑;通过对定向敲除植株开花时间的统计分析,初步确定Bna SDG8参与甘蓝型油菜开花时间的调控。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
陶英杰 刘凤娟 毕春晓 任雪冰 曲瑞红 李科友 徐全乐
【目的】克隆山黧豆β-腈基丙氨酸合成酶基因（CASase）DNA全长序列，构建CRISPR/Cas9敲除载体，为筛选“低毒、高硫”山黧豆品系奠定基础。【方法】以萌发4 d山黧豆幼苗根部为材料，提取其基因组DNA，利用PCR克隆CASase基因全长；经序列同源性、内含子、外显子、sgRNA靶位点和脱靶分析后，在CASase cDNA上选取5个sgRNA靶位点进行寡核苷酸链设计和体外活性检测；从5个sgRNA靶位点中取活性较高的4个sgRNA，利用酶切连接法构建基因敲除载体pPLHACas9-sgRNA20r
[期刊] 水产学报
[作者]
潘启华 陆可 罗君志 蒋月雯 夏必琳 陈磊 王梦洋 戴荣贵 陈天圣
青鳉是研究基因功能、器官发生和发育机制的模式生物之一，基因编辑技术已在青鳉中得到广泛应用，但利用CRISPR/Cas9技术构建青鳉突变体的详细过程还未见报道。为了完整详细地阐明青鳉突变体的构建过程，本研究以青鳉Olpax6.1基因的敲除为例，首先利用ChopChop网站设计获得Olpax6.1基因gRNA的靶点；其次通过PCR扩增和质粒酶切分别获得gRNA和Cas9mRNA体外转录的模板并通过体外转录合成gRNA和Cas9mRNA；再者将Cas9mRNA和gRNA混合进行青鳉胚胎显微注射获得突变F_(0)；最后利用PCR、T7EndonucleaseI酶切和Sanger测序筛选F_(0)与野生型杂交的子代获得相同突变类型的F_(1)，进而将相同突变的F_(1)进行杂交并筛选其子代获得了青鳉Olpax6.1 敲除的纯合突变体，纯合突变体表现出眼部发育畸形的经典表型。本研究为青鳉突变体的构建提供详细完整的实验方案，同时也为其他鱼类突变体的构建提供技术参考。
关键词：
青鳉 Cas9 突变体 基因编辑技术
[期刊] 淡水渔业
[作者]
唐国盘 黄安群 孙志鹏 匡友谊 王胜杰 王大伟
比较三种常用的CRISPR/Cas9基因敲除检测变异方法,从准确性、耗时、成本和应用限制等方面进行评估。采用T7核酸内切酶I、限制性内切酶和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法分别对利用CRISPR/Cas9方法敲除的fibinb和ngs基因的50尾斑马鱼(Danio rerio)突变纯合个体和突变杂合个体进行检测,用野生型个体作对照;同时用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对CRISPR/Cas9方法敲除的ogn和ddb1基因的突变杂合个体进行了检测。结果表明:三种方法均能够区分突变杂合个体,其中T7核酸内切酶I检测法耗时最短,但该方法不能用于鉴定突变纯合个体;限制性内切酶检测法能够用于鉴定纯合个体,但需要有特异性的识别位点;非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法能够区分纯合和杂合个体,对序列无依赖性,能够检测出序列中存在的所有变异。成本上,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法最经济;限制性内切酶的价格存在较大的差异,因此检测成本依赖于酶的价格。三种检测方法各有优缺点,在应用实践中可根据试验需要选择合适的方法。
[期刊] 华北农学报
[作者]
杜想想 赵亚帆 赵晨云 赵帅兵 李源 程远 赵全志 杜彦修 孙红正 孙虎威 彭廷
为研究水稻生长素响应因子OsARF12在水稻生长发育中的作用,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,设计OsARF12 2个不同外显子突变靶点,化学合成包括突变靶点的特异性序列,并与中间载体sgRNA连接进而与Cas9终载体重组获得OsARF12 2个不同突变靶点的表达载体。选取测序成功的单一克隆,利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴,获得转基因植株,并结合测序结果分析突变单株的突变类型,T_1突变体KO-ARF12-1有3种纯合突变、2种双等位突变,共5种突变类型;KO-ARF12-2有6种纯合突变、4种双等位突变和1种杂合突变,共11种突变类型。挑选突变类型为缺失1 nt、缺失4 nt、缺失7 nt和缺失2 nt插入1 nt、缺失5 nt的株系作为研究对象,荧光定量PCR鉴定结果表明,OsARF12在突变体中的表达量较野生型极显著下降(P
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
蔡梦颖 张平 宋炜涵 余江峰 郝栖贤 王平 刘世家 王益华 江玲 万建民
[目的] 本文旨在利用基因编辑技术，降低水稻直链淀粉含量，改善稻米食味品质特性，以培育直链淀粉含量降低的优质育种材料。[方法] 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，下调水稻品种‘宁粳4号’淀粉合酶基因（SSSIIb）的表达，对转基因家系进行目标基因的分子鉴定和主要农艺性状、生理生化指标的测定，选出目标育种材料。[结果] 对淀粉合酶基因SSSIIb进行多靶位点编辑，得到3个目标基因敲除的转基因家系，分别为SSS2-Q、SSS2-Z和SSS2-H家系。与‘宁粳4号’相比，SSS2-Q家系直链淀粉含量显著下降，支链淀粉链长分布呈现中等链长减少，而胶稠度和热浆黏度、冷浆黏度等指标均优于‘宁粳4号’，品质指标达到预期目标，但每穗实粒数和结实率降低，粒长增加。而在SSS2-Z与SSS2-H家系中，品质指标没有实现预期目标。RT-qPCR分析发现，SSS2-Q家系中SSSIIb基因表达下调，其他淀粉合成相关基因表达出现变化。[结论] 通过CRISPR/Cas9技术，靶向编辑了‘宁粳4号’中SSSIIb基因，降低了SSS2-Q家系直链淀粉含量，品质指标得到改善，为优质食味转基因水稻新品种培育提供新种质。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
靳泽华 谢梦利 易辰阳 黄英 付磊 王晓萍 张安定
为证实基于慢病毒的CRISPR/Cas9基因编辑技术可用于鸡基因组编辑,以鸡的mavs基因为靶基因,通过设计sgRNA,构建表达靶向mavs基因sgRNA的重组慢病毒,并将其感染DF1-Cas9细胞,通过T7E1酶切试验以及mavs基因的靶向序列测定,分析该方法是否可以用于鸡细胞的基因编辑。扩增sgRNA靶向序列1 220 bp片段,经T7E1酶切琼脂糖凝胶分析可见约300 bp和900 bp大小的条带,表明感染sgRNA慢病毒的细胞mavs产生了突变。序列测定结果表明sgRNA靶向序列发生了多个碱基缺失的突变。以上结果表明基于慢病毒系统的CRISPR/Cas9技术可对鸡基因组进行编辑。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
朱哲 胡沛男 李伟明 祖尧
转录因子TBX20在脊椎动物心脏的腔室发育和维护中起至关重要的作用。利用CRISPR/Cas9系统成功制备了斑马鱼tbx20突变鱼系,T7E1检测结果显示F_0敲除效率平均为42. 1%,测序分析F_1中突变种质遗传效率为36. 7%。F_2突变体中观察到心脏突变表型:48 hpf,心包腔肿大,静脉窦瘀血,环化异常,心脏结构变形; 3 dpf,心脏畸形拉伸成线状结构。原位杂交和qRT-PCR结果显示,突变体中vmhc表达上调,amhc和myl7表达下调。成功制备了斑马鱼tbx20突变体,结果表明tbx20纯合突变体心脏畸形,环化受到影响,为深入探究tbx20在早期心脏腔室分化过程中的作用奠定了基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘维 刘浩 董双玉 古丰玮 陈志强 王加峰 王慧
CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行有效定点编辑,为作物的遗传育种提供了新的方向。以感病水稻品种丽江为材料,抗病基因OsCOL9为靶基因,探索该系统对水稻内源基因定点编辑效率以及获得有研究意义的突变体。OsCOL9基因CDS序列全长1 266 bp,编码一个422 aa蛋白,分子量大小约为45.6 k Da,蛋白质结构的N端含有B-box结构域,C端含有CCT(CONSTANS、CONSTANS-Like、TOC1)结构域。设计4个长20 nt的guide RNAs(gRNAs)靶点,靶向编辑
[期刊] 中国水产科学
[作者]
唐冬生 严霞 李芳 张细权 蒋泓 于辉 高东 李月琴 周天鸿
以鳜鱼(Sinipercachuatsi)为研究对象,以其重复的rRNA基因间的间隔序列为靶位点构建多位点基因打靶载体,为建立体内多位点基因打靶技术获得关键材料。先构建含TK和Neo基因的通用打靶载体pCTKNeo。采用LATaq高保真酶扩增获得左、右同源重组引导臂HRDS1、HRDS2,经T质粒克隆后,分别插入到pCTKNeo载体Neo基因的上下游,构建成鳜鱼专用的多位点打靶载体pCTKNeoHRDS1/2。同样将干扰素基因hIFN插入到pCTKNeoHRDS1/2载体的Neo基因与HDRS2之间。每次克隆均经PCR、酶切和测序等鉴定DNA片段的插入及插入方向,最终构建成多位点基因打靶载体p...
关键词：
基因打靶 多基因座 载体 重复序列 鳜鱼
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