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[期刊] 水产学报
[作者]
王虹 彭爽 刘佳喜 陈德芳 王艳 耿毅 汪开毓 李志琼 黄小丽 欧阳萍
为了解齐口裂腹鱼高迁移率蛋白B1 (Schizothorax prenanti high mobility group box1,SpHMGB1)的序列特征及其与嗜水气单胞菌胁迫的相关性,实验根据齐口裂腹鱼脾脏TSA库中获得的序列设计引物,采用克隆技术克隆SpHMGB1的核心序列并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR (qPCR)技术检测嗜水气单胞菌在体和离体胁迫后组织和巨噬细胞中Sp HMGB1的响应情况。序列分析结果显示,Sp HMGB1开放阅读框长为615 bp,编码204个氨基酸,理论分子量为23.5 ku,等电点为6.79,包含2个基本的HMG盒:A盒和B盒,以及一个酸性尾巴。SpHMGB1二级结构主要由47.06%的α-螺旋和50%的无规则卷曲构成。系统进化树分析显示,SpHMGB1与鱼类HMGB1聚为一支,与斑马鱼和鲫的亲缘关系最近,氨基酸一致性分别为90.7%和90.4%。qPCR检测结果显示,嗜水气单胞菌感染后SpHMGB1具有不同的时空表达趋势,其中血液在72 h表达量最高,肾脏在6 h表达量最高,脾脏在120 h表达量最高;热灭活嗜水气单胞菌刺激巨噬细胞后,SpHMGB1的表达量在0.5～24 h下调,24 h表达量最低,细胞因子IL-1β和TNF-α表达量均有上调趋势。qPCR检测结果提示,SpHMGB1可能参与齐口裂腹鱼细菌感染后的免疫响应。本实验可为进一步研究SpHMGB1在齐口裂腹鱼细菌性疾病中的免疫调节机制提供参考。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
罗辉 杨月静 向梦斌 叶华 郑曙明 王晓清
为了研究嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)对齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)血液生理生化指标的影响,将180尾齐口裂腹鱼平均分成6组(4、24和48 h对照组;4、24和48 h感染组)。对照组腹腔注射0.2 mL0.65%的无菌生理盐水,感染组腹腔注射0.2 mL 2.5×107CFU/mL的嗜水气单胞菌液。分别测定4、24和48 h对照组和感染组齐口裂腹鱼各项血液生理生化指标,并对肾脏、肝脏和肌肉组织进行病理学观察。结果显示:谷丙转氨酶、白蛋白、总胆固醇、
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
刘志峰 马爱军 孙建华 朱理光 包玉龙 张涛 俞兰良
鱼类的生长和繁殖受环境条件的调节，冬季的低温会给红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)产业带来不利影响。为研究红鳍东方鲀耐低温机制，本研究利用实时荧光定量PCR技术，分析抗冻蛋白(AFP)基因、冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)基因、高速迁移蛋白家族蛋白(HMGB1)基因、Y-box结合蛋白(YB-1)基因在不同温度条件下(18℃、13℃、8℃和5℃)，在红鳍东方鲀的肝、脾、肾、脑、心、肠、肌肉、性腺和皮中的表达情况。结果显示，AFP基因呈广泛性表达，在肌肉中表达量最高(P<0.05)，随着温度的降低，各组织中AFP基因的表达量基本呈显著升高的趋势，在5℃组达到最高值，显著高于对照组(P<0.05)。CIRP基因在肌肉中表达量最高(P<0.05)，随着温度的降低，各组织中CIRP基因的表达量的升降程度有所不同，在肝、肾、脑、心、肠、皮中的表达量呈先升高后降低再升高的趋势，在脾、肌肉和性腺中表达量呈上升趋势。HMGB1基因在肌肉中表达量最高(P<0.05)，在脑、心、肝和皮中也有较高的表达量；随着温度的降低，除肝脏外，各组织中HMGB1基因的表达量基本呈先升高后降低的趋势，并在8℃组达到最大值，显著高于其他各组(P<0.05)。YB-1基因在肌肉中表达量最高(P<0.05)，在其他组织中表达量较低；随着温度的降低，大部分组织中(脑、心、肠、肾、肝、肌肉和脾)表达量呈先升高后降低再升高的趋势，在8℃组达到最小值(P<0.05)。以上结果表明，4种基因表达水平因组织、温度的不同而不同，反映了这4种基因的功能特异性；在低温胁迫下，4种基因积极响应，表达量均发生不同程度的变化，表明4种基因在红鳍东方鲀低温环境适应中可能具有潜在的重要作用。另外，从表达变化规律来看，8℃可能是红鳍东方鲀应对低温胁迫的关键调控点，过低的温度会造成其调控紊乱，这可为研究红鳍东方鲀低温应答调控机制提供相关依据。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
刘志峰 马爱军 孙建华 朱理光 包玉龙 张涛 俞兰良
鱼类的生长和繁殖受环境条件的调节，冬季的低温会给红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)产业带来不利影响。为研究红鳍东方鲀耐低温机制，本研究利用实时荧光定量PCR技术，分析抗冻蛋白(AFP)基因、冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)基因、高速迁移蛋白家族蛋白(HMGB1)基因、Y-box结合蛋白(YB-1)基因在不同温度条件下(18℃、13℃、8℃和5℃)，在红鳍东方鲀的肝、脾、肾、脑、心、肠、肌肉、性腺和皮中的表达情况。结果显示，AFP基因呈广泛性表达，在肌肉中表达量最高(P<0.05)，随着温度的降低，各组织中AFP基因的表达量基本呈显著升高的趋势，在5℃组达到最高值，显著高于对照组(P<0.05)。CIRP基因在肌肉中表达量最高(P<0.05)，随着温度的降低，各组织中CIRP基因的表达量的升降程度有所不同，在肝、肾、脑、心、肠、皮中的表达量呈先升高后降低再升高的趋势，在脾、肌肉和性腺中表达量呈上升趋势。HMGB1基因在肌肉中表达量最高(P<0.05)，在脑、心、肝和皮中也有较高的表达量；随着温度的降低，除肝脏外，各组织中HMGB1基因的表达量基本呈先升高后降低的趋势，并在8℃组达到最大值，显著高于其他各组(P<0.05)。YB-1基因在肌肉中表达量最高(P<0.05)，在其他组织中表达量较低；随着温度的降低，大部分组织中(脑、心、肠、肾、肝、肌肉和脾)表达量呈先升高后降低再升高的趋势，在8℃组达到最小值(P<0.05)。以上结果表明，4种基因表达水平因组织、温度的不同而不同，反映了这4种基因的功能特异性；在低温胁迫下，4种基因积极响应，表达量均发生不同程度的变化，表明4种基因在红鳍东方鲀低温环境适应中可能具有潜在的重要作用。另外，从表达变化规律来看，8℃可能是红鳍东方鲀应对低温胁迫的关键调控点，过低的温度会造成其调控紊乱，这可为研究红鳍东方鲀低温应答调控机制提供相关依据。
[期刊] 水产学报
[作者]
储卫华 陆承平
根据已发表的气单胞菌胞外蛋白酶基因核苷酸序列,设计和合成了一对引物,以嗜水气单胞菌AhJ-1的基因组DNA为模板,通过PCR技术,扩增到约900bp的丝氨酸蛋白酶基因片段,并克隆到质粒载体pGEM-T中进行测序和分析,结果表明扩增的丝氨酸蛋白酶基因片段与已发表的嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶Ahe2的同源性有87％,扩增片段编码343个氮基酸,推测的分子量为35700,计算机软件分析表明编码的氨基酸有较高的抗原性,可作为核酸疫苗的侯选基因片段。
关键词：
嗜水气单胞菌 丝氨酸蛋白酶基因 克隆
[期刊] 水产学报
[作者]
龚晖 林天龙 俞伏松 董传甫 陈日升 杨金先 陈振海
应用PCR技术,从1株鳗源嗜水气单胞菌ML316中扩增得到β 溶血素基因AHL316HEM,将AHL316HEM克隆到pGEM TEasyVector,经分析验证后重组到pcDNA3.0中,构建了重组质粒PDLH。转化重组质粒PDLH的大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α能在血琼脂培养皿中形成明显的β 溶血斑,重组菌纯化的胞外产物溶血价为1.28×104HU·mg-1,同时重组菌的胞外产物能被原始菌株的高免血清特异性地识别。结果证实,克隆到鳗源嗜水气单胞菌β 溶血素基因,重组质粒PDLH能够表达具有天然生物学活性的β 溶血素,为构建嗜水气单胞菌核酸疫苗奠定了基础。
关键词：
嗜水气单胞菌 β-溶血素基因 克隆 表达
[期刊] 水产学报
[作者]
欧阳岁东 林天龙 陈孝煊 俞伏松 龚晖 陈红燕 方勤美
A pair of primers were designed according to the published nucleotide sequence of a putative outer membrane protein gene(omp) of Aeromonas hydrophila.With the specific primers,a target fragment about 1.1 kb was amplified from Aeromonas hydrophila ML316 via PCR.The target fragment was inserted into t...
[期刊] 水产学报
[作者]
陈德芳 芦路 蒲云丹 瞿炼石 刘博 黄小丽 欧阳萍 李志琼 耿毅
为探究齐口裂腹鱼热休克蛋白60（Schizothorax prenanti Heat shock protein 60， SpHsp60）cDNA基因序列的分子特征和在细菌感染中的响应情况，实验利用RACE技术克隆获得了2 277 bp的SpHsp60 cDNA序列，预测编码575个氨基酸，其与脊椎动物具有较高的保守性；齐口裂腹鱼的组织表达模式分析显示，SpHsp60在肝胰脏表达量最高，血液次之，而在皮肤、肌肉和肠道中表达量低；无乳链球菌感染过程中，血液、肝胰脏、中肾和脾脏的SpHsp60 mRNA表达量在感染后6 h发生显著性变化，提示组织中SpHsp60能快速响应感染；且肝胰脏和中肾在感染后6 h～72 h表达量变化均显著高于对照组，而脾脏则显著低于对照组。研究表明SpHsp60可能通过快速响应参与齐口裂腹鱼对抗细菌感染的过程，研究为肝胰脏和中肾组织中Hsp60 mRNA表达量作为齐口裂腹鱼感染无乳链球菌的危险信号分子提供基础数据。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
任燕 陆承平 姚火春
根据已发表的人源嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)温敏胞外蛋白酶基因eprA1的核甘酸序列,设计合成一对引物,以嗜水气单胞菌鱼源株Ah J-1基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到1 005 bp的胞外蛋白酶基因eprJ1,将该基因片段连接到pMD18-T载体中,构建克隆载体pMD-eprJ1。序列分析发现,其与发表的Ah AH1的胞外蛋白酶eprA1基因的同源性有91%。根据测序结果在保守区重新设计一对引物以增强特异性,扩增片段大小为387 bp。对1990~2004年15年间从浙江、福建、湖北及江苏等地不同患病水产动物肝肾等脏器分离到的23株Ah检测结果显示,从...
[期刊] 水产学报
[作者]
王俊丽 闫潇 卢荣华 秦超彬 梁丽娜 刘燕琴 聂国兴
[期刊] 水产学报
[作者]
朱成科 王建 陈灵涵 周朝伟 雷骆 邓星星 刘春 郑宗林
趋化因子是一类能够吸引白细胞移行到感染部位的低分子量(810 ku)蛋白质,在炎症反应、非特异性免疫反应中具有重要作用。实验克隆了剑尾鱼2个趋化因子基因(CCL4、CCL19)c DNA序列,运用荧光定量PCR技术检测其在健康组织和嗜水气单胞菌感染后肝、脾中的表达情况。结果显示,剑尾鱼CCL4和CCL19开放阅读框长度分别为294和333 bp,分别编码97和110个氨基酸,推导氨基酸序列均含有趋化因子CC家族标志性的4个半胱氨酸残基,与其他物种尼罗罗非鱼、鼠、狗、人、鸡的氨基酸序列相似性比较,CCL4相
[期刊] 水产学报
[作者]
黄晓 叶巧真 何建国 谢俊峰 王顺强
根据已发表的外膜蛋白基因ompII的核苷酸序列设计引物 ,从分离自患红底板病的中华鳖的嗜水气单胞菌中扩增得到了ompTS基因。对ompTS基因进行序列分析 ,发现其与ompII基因的核苷酸序列有 83.5 %的同源性。ompTS基因最长的开放阅读框 (ORF)为 10 6 8nt,编码由 35 5个氨基酸组成 ,分子量为 38.9kDa的蛋白质OmpTS ,其氨基酸序列的前 2 0个氨基酸残基可能组成信号肽。由ompTS基因推导的编码氨基酸序列与其它细菌外膜蛋白的氨基酸序列的比较结果 ,进一步证实细菌外膜蛋白氨基酸序列的N端存在高度保守区。根据序列分析结果推测 ,ompTS基因很可能是一个新的...
关键词：
嗜水气单胞菌 外膜蛋白 ompTS基因
[期刊] 西南农业学报
[作者]
王利 魏勇 龙钟明 刘港彪 苟小兰
同种移植炎症因子AIF-1是一种细胞质的钙离子结合蛋白。本研究采用RT-PCR方法从齐口裂腹鱼脾脏中克隆到AIF-1,并运用生物信息学方法预测其蛋白质结构。结果表明:齐口裂腹鱼AIF-1基因包含一个444 bp的完整阅读框,编码一个由147个氨基酸组成的蛋白。AIF-1蛋白预测分子量为16.5 KDa,理论pI为4.43,无信号肽,有一个跨膜区,二级结构以α-螺旋为主,未见β-折叠区。同源建模显示齐口裂腹鱼AIF-1蛋白与已测定的小神经胶质细胞特定蛋白具有非常相似的三级结构。这为深入研究AIF-1分子结构和功能积累了参考资料。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李宇伟 连瑞丽 王新民
【目的】克隆蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)低温胁迫响应基因MtbHLH-1,并对其进行序列特征分析,研究MtbHLH-1对牧草蒺藜苜蓿耐低温能力的影响。【方法】利用RT-PCR技术获得蒺藜苜蓿MtbHLH-1全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用半定量RT-PCR研究MtbHLH-1的低温(4℃)表达模式。【结果】测序结果显示,cDNA片段全长778 bp,包含一个741 bp完整的开放阅读框,编码246个氨基酸残基,命名为MtbHLH-1,GenBank登录号为JN800447。氨基酸BLAST分析表明,MtbHLH-1氨基酸序列与已报道的其它植物(大豆、拟...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
杜娜 顾泽茂 袁军法 林蠡 翟艳花 刘学芹 罗宇良
根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)气溶素(aerolysin,Aer)基因的序列设计引物,以来自湖北的鱼源A.hydrophila分离株为模板扩增出aer基因的ORF序列,克隆到pMD18-T载体上进行序列测定。测序结果表明,A.hydrophila的aer基因的系统进化树中国内菌株聚为一支,国外菌株聚为一支。通过pET-32a(+)载体构建Ah15株aer基因的表达载体pET32a-15,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行诱导表达,通过SDS-PAGE分析,显示与预期大小约72.2ku相吻合的融合蛋白带,且以包涵体形式存在。浓缩后的...
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