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[期刊] 华北农学报
[作者]
刘加爱 陈蕾 林元山 张小鹃 邹洪彬 张学文
为了以酿酒酵母S78为宿主菌异源高效表达糖化酶基因,进一步扩大糖化酶基因在工业生产上的应用。运用RT-PCR法从黑曲霉中克隆得到糖化酶基因(glaA)cDNA,去除其信号肽编码区后的序列重组到酵母表达载体pVT102U/αADH1强启动子下游,并与α因子分泌肽信号序列融合。用PEG/LiAc法将构建的重组表达载体转入酿酒酵母S78菌株,筛选出的转化菌点种到可溶性淀粉平板上培养,用碘染法鉴定重组基因的表达情况。鉴定出了典型水解圈的酵母转化子,转化子接种到YPD培养基中摇瓶培养后,取发酵上清液经SDS-PAG
关键词：
黑曲霉 糖化酶 酿酒酵母 异源表达
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
涂珺 朱平 程克棣
天然产物紫杉醇是一种重要的抗癌药。其天然来源的匮乏和缺少商业上可行的化学全合成促进了对紫杉醇生物来源的深入研究。紫杉醇的生物合成是一个复杂的多步过程,主要包括四环骨架的构建和加入各种羟基和酰基基团,其中羟基的加入由细胞色素P450氧化酶催化。我们从中国红豆杉愈伤组织细胞mRNA构建的cDNA文库中克隆得到几个P450 cDNA片段。其中一个长1 494 bp的cDNA片段,编码497个氨基酸,推断蛋白分子量为56470 Da,等电点为9.42。序列比较显示,这个推断蛋白包含多个细胞色素P450氧化酶的保守区,具有典型的细胞色素P450氧化酶的特征,进一步的比较发现其与已鉴定的东北红豆杉紫杉烷-...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘延琳 李华
【目的】进行中国自行筛选的专利菌种酒酒球菌SD-2a(Oenococcus oeni SD-2a)的苹果酸-乳酸酶基因在酿酒酵母中的整合型表达,使葡萄酒生产过程中的酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation,MLF)同时进行。【方法】克隆Oenococcus oeni SD-2a的苹果酸-乳酸酶基因mleA,以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件,以酵母整合型质粒YIp5为载体,构建重组表达质粒pYILmleA,并转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS59,经筛选鉴定获得酵母转化子YS59/pYILmleA。进行转化子的营养缺...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
张桂敏 张晚鸣 何国帮 马立新
根据文献报道的烟曲霉植酸酶序列,设计引物以烟曲霉CCTCCAF93044的总DNA为模板进行梯度PCR,扩增出了1条约1.4 kb的带,将该片段进行DNA序列测定,其序列与已报道的烟曲霉植酸酶序列完全一致,但只编码完整的成熟植酸酶序列。将该片段克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K上,获得表达质粒pHBM108。该质粒转化毕赤酵母KM71所得重组子经PCR验证后进行诱导表达,其中一重组子经144 h诱导,植酸酶表达量至少为1.25 mg/ml,比同类报道的表达量高出60％以上,以植酸钠为底物测得酶活为11.17U/ml。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张梁 石贵阳 王正祥 章克昌
采用基因敲除技术,在工业酿酒酵母染色体DNA上的甘油代谢途径关键酶基因GD P 1中,整合入来源于里氏木霉的β-葡萄糖苷酶基因bgⅡl,通过提高G 418浓度筛选得到多拷贝整合子。结果表明,整合子利用纤维二糖的能力得到提高,产甘油能力下降,外源基因表达稳定;引入外源基因后,其对酵母增殖能力没有大的影响,仅形态发生变化;在以微晶纤维素为原料,结合纤维素酶发酵时,与亲代工业酿酒酵母相比,发酵液乙醇浓度最高增加69%。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘林丽 王跃进
应用基因重组技术,将从华东葡萄白河-35-1中分离出的长1179 bp芪合酶(stilbene synthase,STS)基因的cDNA片段克隆入大肠杆菌-酵母菌穿梭型诱导表达载体pYES6/CT上,构建重组酵母真核表达质粒pYES6/CT-STS,转化酿酒酵母菌株INVSc1,用Blasticidin(bsd)筛选出阳性克隆转化子,经半乳糖诱导表达后进行5个时间段菌体全蛋白SDS-PAGE电泳和Western-blot分析。结果发现,诱导4 h后开始有目标带(48 ku)出现,诱导16 h开始大量且稳定表达。证明目的基因片段可以在酿酒酵母中表达,为后续基因功能的验证奠定了基础。
关键词：
芪合酶 酵母表达载体 载体构建 诱导表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
马丽娜 陈喜文 陈德富
对4种糖化酶工业株的rDNA片段进行克隆,在对比其rDNA-ITS1序列与GenBank数据库的基础上,结合形态学观察对菌株进行了鉴定。结果显示,4种菌株分别为黑曲霉、无花果曲霉、米曲霉和灰色小克银汉霉。通过Me-gAlign得到的进化树表明,前3种菌株亲缘关系较近,三者与灰色小克银汉霉的亲缘关系较远。进一步克隆了黑曲霉、无花果曲霉和米曲霉的糖化酶基因,并在毕赤酵母中实现了分泌表达。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
黄鹭强 张丽萍 雷秀清 林志钦 郑宝东
以粟酒裂殖酵母基因组DNA为模版,逆转录获得cDNA;以cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增,得到苹果酸通透酶(mae1)基因,将其与pMD-18T连接并测序.结果表明cDNA全长为1316 bp,编码438氨基酸,分子质量49ku,与已报道的mae1基因序列的同源性达到99%.mae1与整合型表达质粒pSH47连接后,用重组的表达质粒转化产朊假丝酵母,经PCR验证筛选阳性克隆子.通过对转化子的摇瓶筛选,发现重组子的降酸幅度均大于原始菌株,培养40 h降解了48.6%的L-苹果酸,降解率比原始菌株提高了9.8%.
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
黄君 张昌毅 赵述淼 梁运祥
利用RT-PCR技术,提取黑曲霉(Aspergillusniger)L3的总RNA进行反转录,并通过PCR扩增得到去除天然信号肽的β-1,4-葡聚糖酶基因egⅠ,将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,使之位于α-因子信号肽下游,并与之同框,构建重组表达质粒pPIC9k-egⅠ,电击转化毕赤酵母GS115,经MM、MD、CMC-Na和G418平板筛选,得到重组毕赤酵母工程菌1#和5#,在摇瓶中β-1,4-葡聚糖酶酶活分别达到1456U/mL和1928U/mL。重组酶最适温度为70℃,最适pH为5.0。
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
闻雅男 王学英 夏润玺 王媛媛
为获得大量、高活性植酸酶以及研究和开发新型微生物生物制剂,从自行筛选的黑曲霉中提取RNA,通过反转录合成模板cDNA,根据phyA成熟肽编码序列设计出一对引物,PCR扩增phyA,对扩增片段进行了克隆,通过限制性内切酶酶切分析、DNA测序证明phyA基因克隆成功。从pBS-T-phyA克隆中获取phyA编码序列,将其与pET28a+质粒连接,构建pET28a+-phyA重组质粒,并在大肠杆菌中获得高效表达。本研究成功克隆phyA,该基因全长1404bp,以ATG为起始密码子,TGA为终止密码子,编码467个氨基酸组成的多肽。SDS-PAGE电泳结果表明,phyA在大肠杆菌中成功表达,成熟植酸酶...
[期刊] 水产学报
[作者]
胡澄溪 刘伟 毕燕会 周志刚
三酰甘油（TAG）合成缺陷型酿酒酵母突变株H1246常用于其他生物二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）的基因功能鉴定。为了解外源DGAT的基因表达对酵母细胞脂质及生长的影响，实验将缺刻缘绿藻1个I型和3个II型的DGAT分别转化H1246菌株，经筛选获得tDGAT1、tDGAT2A、tDGAT2B及tDGAT2C等4株转目的基因酵母。通过显微观察、分光光度法、重量法、棒状色谱分析、气相色谱-质谱分析对酿酒酵母的形态和脂滴、细胞密度、生物量、总脂、总脂肪酸以及TAG含量进行检测。稳定生长期时的显微观察结果显示，这4个外源基因均能使H1246菌株恢复TAG的合成和贮存能力进而在细胞中出现油滴；油脂分析结果表明，tDGAT1菌株的TAG及脂肪酸含量最高，且显著高于野生型Scy62及其他3株转目的基因菌株的水平；生长性能的数据显示，4个外源基因均能使H1246菌株的细胞密度达到Scy62的水平，这可能是由于TAG的合成消耗了游离脂肪酸，以减轻其对细胞产生的伤害而致；但tDGAT1菌株的生长迟滞期明显延长，以致其生长速率最低。本研究结果表明，将缺刻缘绿藻不同类型的外源DGAT转化酿酒酵母后，使后者的生长性能及脂质含量产生不同的变化。该结果为利用基因工程改造酵母菌株以生产人类所需要的目的油脂研究奠定了基础。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
张茂 刘德武 林纯 贺晓燕 孟繁明 周庆丰 杜云平 吴珍芳
从黑曲霉(Aspergillus niger)GI M3.452中克隆得到木聚糖酶基因xynA的成熟肽编码序列。通过重叠延伸PCR将不带原基因信号肽编码序列的xynA基因片段和猪腮腺分泌蛋白(parotid secretory protein,PSP)基因的信号肽进行拼接得到融合片段SPA,并将其克隆到真核表达载体pcDNA6/HisTMA中,得到重组质粒pcDNA-SPA,重组质粒经过酶切、测序鉴定其读码框的正确性,在脂质体介导下将重组质粒pcDNA-SPA转染猪肾细胞(PK15),通过RT-PCR证实其在PK15细胞中表达,并在细胞培养液中检测到木聚糖酶活性为7.6I U/mL。
关键词：
黑曲霉 木聚糖酶 xynA基因 真核表达
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
李雯 陶妍
从鲤鱼鳃组织中分离克隆到一种新的g型溶菌酶同工型基因(CLYG).该基因的全长cDNA为558 bp,除去终止密码子,编码185个氨基酸,推断的氨基酸序列没有信号肽,含3个催化位点(谷氨酸73、脯氨酸86和天冬氨酸97),具有鱼类g型溶菌酶的基本特征.通过PCR方法在CLYG基因的5'和3'端分别引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点.扩增到的目的片段与表达载体pPICZαA连接构建重组表达载体pPICZαA-CLYG后,电转至毕赤酵母X-33,筛选得到的阳性转化子在1.0%甲醇、29℃、pH 6.0的条件下诱导
关键词：
鲤鱼 g型溶菌酶 毕赤酵母 重组表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
赵育 李海兰 杜君 战吉宬
【目的】研究铜胁迫下,酿酒酵母胞内海藻糖的积累情况及海藻糖对酿酒酵母的保护作用,为探讨铜胁迫下酿酒酵母的防御保护机制提供理论依据。【方法】以改良模拟葡萄汁为发酵培养基,分别对菌株AWRI、BH8和Freddo进行直接铜胁迫处理(Cu2+浓度为1.00 mmol.L-1)、热激预处理(37oC,1 h)、再铜胁迫处理,同时,设定无铜培养为对照。测定各种处理下酿酒酵母的存活率、胞内海藻糖的积累和6-磷酸海藻糖合成酶(TPS1)酶活性的变化。【结果】与对照相比,1.00 mmol.L-1Cu2+胁迫处理使酵母细胞内海藻糖的含量增加,TPS1酶活性提高。热激预处理可诱导海藻糖的积累,且铜胁迫下细胞的存...
关键词：
铜胁迫 酿酒酵母 海藻糖
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
付永平 李博 王丕武 高玮 夏海丰 张卓
【目的】克隆绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因,并在粟酒裂殖酵母细胞中进行表达分析。【方法】利用PCR技术,从绿色木霉中克隆纤维素酶β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的DNA序列,再通过XhoⅠ和NotⅠ2个酶切位点与粟酒裂殖酵母表达载体pREP5N连接,构建酵母真核表达载体,利用电转化方法转化粟酒裂殖酵母SP-Q01细胞,并在SP-Q01中进行表达分析,最后采用DNS法测定表达产物的酶学活性。【结果】PCR扩增得到2 380bp的bglⅠ基因序列,包括完整的CDS序列和信号肽序列,编码序列与已报道的里氏木霉纤维素酶基因序列相似性为100%;对酵母转化子进行诱导培养后,SDS-PAGE电泳检测得到大小...
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