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[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
张茂 刘德武 林纯 贺晓燕 孟繁明 周庆丰 杜云平 吴珍芳
从黑曲霉(Aspergillus niger)GI M3.452中克隆得到木聚糖酶基因xynA的成熟肽编码序列。通过重叠延伸PCR将不带原基因信号肽编码序列的xynA基因片段和猪腮腺分泌蛋白(parotid secretory protein,PSP)基因的信号肽进行拼接得到融合片段SPA,并将其克隆到真核表达载体pcDNA6/HisTMA中,得到重组质粒pcDNA-SPA,重组质粒经过酶切、测序鉴定其读码框的正确性,在脂质体介导下将重组质粒pcDNA-SPA转染猪肾细胞(PK15),通过RT-PCR证实其在PK15细胞中表达,并在细胞培养液中检测到木聚糖酶活性为7.6I U/mL。
关键词：
黑曲霉 木聚糖酶 xynA基因 真核表达
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
崔罗生 祝茂生 徐顺清 朱辉 梁运祥 张忠明
从黑曲霉(Aspergillus niger)F19中克隆得到木聚糖酶基因xynA。将不带原基因信号肽编码序列的xynA基因片段以正确的阅读框架克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET-28a(+)上,并转化E.co-liBL21,获得重组工程菌BLX1。经过IPTG诱导,xynA获得特异性表达,其表达产物以包涵体和胞内可溶性蛋白2种形式存在。经过SDS-PAGE分析,重组蛋白分子质量约为24 ku。酶学分析表明,最适反应温度为50℃,最适反应pH为5.0,在酸性条件下具有较好的稳定性。
关键词：
黑曲霉 木聚糖酶 xynA基因 酶学性质
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
靳敏峰 侯喜林
根据其他植物的β-1,3-葡聚糖酶基因保守域序列设计简并引物,扩增出青花菜β-1,3-葡聚糖酶基因的中心区段,结合5′RACE和3′RACE技术获得该基因的5′端序列和3′端序列,经序列拼接获得1个1 277 bp的cDNA,在GenBank中登录号为EF484879,定名为BObg。序列分析结果表明,该cDNA包含1个1 056 bp的开放阅读框,编码352个氨基酸,其理论上的等电点PI=7.314,相对分子质量为3.892×104,聚类分析显示该序列与已报道的其他植物的β-1,3-葡聚糖酶基因具有较高氨基酸序列同源性。利用未接种和接种霜霉病后不同时期的青花菜植株细胞进行半定量RT-PCR分...
[期刊] 草业科学
[作者]
刁桂萍 杨帅 遇文婧
从棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ACCC30536中克隆获得一个葡聚糖酶基因Glu1,其cDNA全长984bp,编码327个氨基酸。该葡聚糖酶属于Glyco-hydro-12家族,推测为β-1,4-葡聚糖酶,与深绿木霉IMI 206040的Glycohydro-12家族蛋白(XP_013940397.1)有91%相似性,且亲缘关系较近。运用qRT-PCR技术检测9种诱导条件下棘孢木霉Glu1基因的表达水平,结果表明,Glu1基因能参与棘孢木霉对山新杨(Populus davidiana×P.alba var.pyramidlis)或杨树病原菌的识别。构建原核表达载体并获得重组蛋白rGlu1。酶活特性分析结果表明,该酶最适pH为4.5,最适温度为45℃,且酶活性随诱导时间延长逐渐升高,在5h达到稳定。
[期刊] 华北农学报
[作者]
白爱枝 闫祖威 唐国敏 梁运章
以黑曲霉(Aspergillus niger)A3的基因组DNA为模板,根据已报道的xynB基因序列设计简并引物,在合适的PCR反应条件下有效地扩增出了xynB的结构基因及其5'调控区序列片段,并克隆到pBS-T载体上,序列测定表明,该目的片段全长1611 bp。通过序列分析:结构基因部分长744 bp,其中含有一个66 bp的内含子和18个氨基酸的信号肽序列;xynB基因的cDNA序列大小为678 bp,编码225个氨基酸,与GenBank上检索的木聚糖酶基因的核苷酸序列同源性最高达98%,氨基酸序列同源性达99%。在翻译起始点上游92 bp和118 bp处找到转录起始位点和类"TATA"b...
关键词：
黑曲霉 木聚糖酶 基因克隆 序列分析
[期刊] 海洋渔业
[作者]
苏艳芳 付元帅 施志仪 张红梅 高丽娜
采用RACE-PCR技术,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)组织中克隆了血清应答因子(SRF)基因全长序列,该序列全长2 477 bp,开放阅读框1 503 bp,编码500个氨基酸。通过氨基酸同源序列比对,牙鲆SRF与其它物种的同源性较高,在氨基酸序列的N端具有NLS结构域和高度保守的MADS结构域。用PCR方法扩增SRF基因的编码区片段,克隆到p EGFP-N1载体中,构建真核表达载体p EGFP-N1-SRF,将重组质粒转染牙鲆胚胎细胞,在荧光显微镜下观察转染细胞有绿色荧光蛋白表达。荧光定量PCR和Western blot实验进一步证实,SRF在转染细胞中高表达。说明...
关键词：
SRF 牙鲆 克隆 真核表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王宝维 张倩 葛文华 张名爱 岳斌 黄国清
【目的】鹅源草酸青霉F67(Penicillium oxalicum Currie & Thom)纤维素酶二糖水解酶(cellobiohydrolase,CBHⅠ)基因克隆并构建真核表达载体,为该菌株分子特性的进一步研究及构建高效纤维素分解菌奠定基础。【方法】首先通过兼并PCR法扩增CBHⅠ基因片段,然后利用改良热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术克隆CBHⅠ基因5′端和3′端侧翼序列,最后采用RT-PCR法扩增鹅源草酸青霉F67CBHⅠ基因序列全长,并对该基因进行生物信息学分析,构建pPIC9K真核表达载体。【结果】分别扩增到鹅源草酸青霉F67纤维素酶CBHⅠ基因片段A(EU57473...
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
闫建英 张智 冯丽荣 汤华京 杨可心 魏罡 张晓彤
【目的】在枯草芽孢杆菌中表达绿色木霉(Trichodoma vivide,T.viride)内切葡聚糖酶基因Eg Ⅶ。研究内切葡聚糖酶基因Eg Ⅶ的生物信息、基因克隆与表达及重组酶学性质。【方法】提取纤维素酶生产菌株绿色木霉AS3.3711的总RNA，通过反转录合成cDNA，并以之为模板利用PCR技术扩增获得内切葡聚糖酶基因Eg Ⅶ，并进行生物信息学分析；构建了重组表达载体pMA5-Eg Ⅶ，并利用热激转化法将其转入枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis,B.subtilis）WB600感受态细胞中，成功进行表达。【结果】生物信息学分析表明，内切葡聚糖酶基因Eg Ⅶ编码249个氨基酸，蛋白质的分子量为26.8002 KD，理论等电点7.62，属于胞外蛋白；预测蛋白质三级结构与二级结构一致，由ɑ-螺旋、延伸链区、β-转角和无规则卷曲构成。电泳结果表示，重组枯草芽孢杆菌在Eg Ⅶ基因片段大小符合处出现条带，表明成功将Eg Ⅶ-pMA5转化到B.subtilis WB600中。刚果红染色结果显示重组枯草芽孢杆菌在CMC培养基上出现较大直径的透明圈，重组菌株上清粗酶液DNS酶活力达到22.71 U/mL，表明绿色木霉内切葡聚糖酶基因Eg Ⅶ可以在枯草芽孢杆菌中表达，并具有较高活性。重组酶酶学性质分析表明，该酶的最适温度是60℃，最适pH值为6.4，且温度在50℃以下，pH值在5.6～8.0范围内，酶活力具有良好的稳定性。【结论】通过对内切葡聚糖酶基因Eg Ⅶ克隆及分析，获得了表达内切葡聚糖酶基因Eg Ⅶ的枯草芽孢杆菌基因工程菌，了解了重组酶酶学性质，为纤维素酶的广泛应用提供了理论基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
阚威 王华 马友记 赵兴绪 张勇
为研制奶牛乳房炎无乳链球菌的基因工程疫苗,采集隐性奶牛乳房炎奶样,利用THB(Todd-Hewitt Broth)固体选择培养基和色素试验,并结合无乳链球菌种属特异性基因cfb,采用PCR技术从隐性乳房炎奶样中分离和鉴定无乳链球菌。根据GenBank已报道的链球菌cfb基因序列,经ORF分析和B细胞表位预测,利用Primer 5.0软件设计cfb因子富含B细胞表位区域引物,添加酶切位点和真核表达元件,以分离株无乳链球菌的基因组为模板,PCR扩增cfb基因并连接T载体克隆测序,经测序确定无误后,连接pcDNATM3.1 V5-His A(pcDNA-cfb)真核载体,转化DH5α感受态细胞,提取...
[期刊] 华北农学报
[作者]
迟良 邹明 孙晓凤 刘焕奇
采用RT-PCR方法从乌骨鸡皮肤中克隆出黑色素主效基因黑色素皮质激素受体(Melanocortin1-receptorMC1R)基因,长度为945bp,与普通白鸡比对其同源性为99.6%。以pEGFP-N1为基础,将从测序载体pMD-18T-MC1R上使用EcoR I和Sal I切下的MC1R连接到同样酶切的pEGFP-N1,构建pEGFP-N1-MC1R真核表达载体,为以后转基因动物的制备打下了基础。
关键词：
乌骨鸡 MC1R 真核表达载体
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
于巧平 尹明安 任小林 姜永华
【目的】通过生物信息学分析,将苹果的一段EST序列初步定性为转录因子MdHB-1基因,对该基因进行克隆和真核表达载体构建,为进一步研究其分子生物学功能奠定基础。【方法】根据番茄LeACO1转录因子LeHB-1的基因序列,对苹果EST库进行Blast,获得一段EST序列,根据该EST序列设计1对特异性引物,以"皇家嘎啦"苹果花器总RNA为材料,经RT-PCR得到1条长约1 000bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定及分析。将基因MdHB-1与真核表达载体pPICZA连接,构建真核表达载体pPICZA-MdHB-1,并导入毕赤酵母菌种GS115,通过PCR鉴定该载体的导入情况。【结果】克隆...
[期刊] 林业科学
[作者]
冀宪领 盖英萍 马建平 牟志美
景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(SBPase)是卡尔文循环过程中的关键酶。利用RACE技术得到景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶基因全长cDNA,命名为MSBPase(GenBank登录号:DQ995346)。MSBPase全长为1527bp,该序列含有1个1179bp的完整开放读码框,编码393个氨基酸,蛋白质理论分子质量约为42.6ku,等电点为5.85,其氨基酸序列与其他植物中已分离的SBPase有很高的同源性。对MSBPase编码的蛋白质(命名为MSBPase)进行结构预测分析表明,该蛋白富含无规卷曲(coil),高达64.29%,其次是α-螺旋(helix),为22.19%,而β-折叠(st...
[期刊] 草业科学
[作者]
马春娟 杨宇泽 邹爱爱 孙康永杰 万雪瑞 王川 魏亚琴
为提高纤维素的降解效率、构建高效表达的纤维素酶基因工程菌，本研究以牛瘤胃液微生物全基因组为模板，首先通过PCR扩增内切葡聚糖酶eg基因，然后与pET-28a连接获得表达载体pET-28a::eg并转化至大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BL21(DE3)中，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达EG蛋白，最后用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定重组内切酶的酶活力，分析其酶学性质。结果表明：成功构建表达载体pET-28a::eg，重组菌株E. coli BL21/pET-28a::eg在28℃用IPTG诱导14 h后纯化得到重组的EG蛋白，EG蛋白大小约为50 kDa，刚果红染色有明显水解圈。用DNS法测得EG的酶活为12.60 U·mL~(-1)，滤纸总酶活为3.53 U·mL~(-1)。重组酶在不同底物的反应中，羧甲基纤维素钠为底物的酶活力最高，脱脂棉最低。重组酶的最适温度为40℃，最适pH为7.0。在此条件下，Ca~(2+)、Mg~(2+)、Fe~(2+)、K~+、Mn~(2+)等离子均可对重组蛋白EG的酶活力具有促进作用，Zn~(2+)可促进但差异不显著，而Hg~(2+)、Cu~(2+)对EG的酶活力具有抑制作用。本研究构建的重组内切酶菌株可以高效水解纤维素，为内切酶的工业应用奠定了基础。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张学文 田志坚 吴永尧 周双德 康冬丽
为了通过基因工程方法在大肠杆菌中发酵生产β-甘露聚糖酶,采用多重比较几种来源的β-甘露聚糖酶氨基酸序列,获得了该酶的保守结构域,并按此设计简并引物.以能水解魔芋葡甘聚糖的枯草杆菌属野生筛选菌种A33为材料,通过简并引物PCR法从A33基因组中扩增出β-甘露聚糖酶基因核心区段.经过克隆、测序及BLASTN比对分析,证实该DNA区段推导的编码蛋白具有β-甘露聚糖酶的保守结构域,属于该酶家族中的一员.将该片段构建到大肠杆菌表达载体pRSET-A并转入大肠杆菌表达系统BL21DE3(pLysS),经过诱导获得了此酶的高效表达.
关键词：
β-甘露聚糖酶 基因克隆 表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘博 崔素萍 王晓杰 黄丽丽 康振生
为研究小麦与条锈菌互作过程中β-1,3-葡聚糖酶基因的功能,根据小麦β-1,3-葡聚糖酶cDNA全长序列设计合成引物,通过RT-PCR方法获得小麦β-1,3-葡聚糖酶基因编码区,将其克隆至pGEM T-easy Vector,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切回收目的片断,并将其定向克隆到pET-32a(+)Vector中构建表达载体GLU-pET-32a(+),转化E.coliBL21(DE3),用IPTG进行诱导表达。结果表明,小麦β-1,3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中得到了高效表达,获得了分子量约为49 ku的融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的19%。最佳诱导条件为:0.3 mmol/LIPTG...
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