【背景】黏菌素是人医临床治疗多重耐药革兰阴性菌感染的“最后一道防线”药物，其同时作为饲料添加剂及治疗用药长期用于畜禽养殖业。2015年，我国研究人员首次报道了质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1，预示该道防线面临被攻破的风险。然而，杀菌浓度及亚抑菌浓度的黏菌素对mcr-1阳性质粒传播的影响仍未知。【目的】以流行最广的mcr-1阳性IncI2型质粒为研究对象，探究不同浓度黏菌素对该质粒接合转移频率的影响，为黏菌素的科学使用提供理论依据。【方法】使用肉汤法进行了不同浓度黏菌素（0.02 4μg·mL~(-1)）作用下携带mcr-1的IncI2型质粒的接合转移试验。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR）及构建的公式计算不同时间点（1 24 h）的接合转移频率，并分析不同浓度黏菌素对IncI2质粒接合转移频率的影响。使用PI染料、活性氧（ROS）检测试剂盒测定不同浓度黏菌素下供体菌和受体菌的细胞膜透过性和ROS产生量。选取了对照组与低中高浓度3个处理组（0.02、1、4μg·mL~(-1)）进行了转录组测序，使用Deseq2软件进行基因差异表达分析。采用Prism v8.2.0软件对不同组间接合转移频率、细胞膜透过性及ROS产生量的差异进行统计学分析。【结果】结合本研究建立的接合转移频率计算公式表明黏菌素浓度为4μg·mL~(-1)时可在不同时间点提高mcr-1阳性IncI2质粒3–10倍的接合转移频率，而其他浓度则无显著差异。转录组结果显示，与对照组相比，低中高浓度黏菌素均可显著提高IncI2质粒上IV型分泌系统相关基因的表达，其中包括virB1、virB2、virB5以及traC。此外，黏菌素增加了I型菌毛合成基因fim的转录水平。PI染色结果显示当黏菌素浓度为2和4μg·mL~(-1)时，可增强供体菌和受体菌的细胞膜透过性，且转录组结果也显示膜相关基因（ompAX、bamDE、lolB、yiaD、csgEF）的转录水平均出现显著上调。但是黏菌素作用后ROS产生量及相关基因的转录水平无显著提高。【结论】揭示了黏菌素可通过增加细菌IV型分泌系统活性、细胞膜透过性和菌毛的生成从而提高mcr-1阳性IncI2质粒在大肠杆菌间的接合转移频率。研究结果提示，杀菌浓度无法完全杀死mcr-1阳性大肠杆菌的同时，还能增加质粒传播速度。因此，畜禽养殖业中黏菌素的治疗使用可能维持mcr-1阳性质粒的存在及传播，此外鉴于黏菌素已批准用于人医临床，该现象有可能引起临床黏菌素治疗mcr-1阳性病原菌的失败。

[目的]本研究旨在探讨生产中普遍存在的急性应激因素对细菌耐药基因水平转移的可能影响。[方法]选取分离自断奶香猪粪便的2株喹诺酮类敏感型大肠杆菌作为试验菌株,通过测定D600值比较菌株在添加不同浓度去甲肾上腺素培养液中的生长曲线,确定去甲肾上腺素对于大肠杆菌的最佳促生长浓度;分离自断奶香猪粪便的7株携带质粒喹诺酮类耐药基因(aac(6')-lb-cr、oqx AB、qnr S)的大肠杆菌,采用滤膜接合法,计算去甲肾上腺素诱导和未诱导的大肠杆菌分离株(供体菌)与大肠杆菌J53(受体菌)的接合转移率;PCR检测

为了解四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1耐药基因流行情况,及其与超广谱β-内酰胺酶基因(ESBLs)共存和共转移的特征,采用微量肉汤稀释法检测菌株对不同抗菌药物的敏感性;采用PCR检测菌株mcr-1,以及mcr-1阳性菌株中ESBLs基因类型;采用质粒接合转移试验分析了mcr-1与ESBLs基因共转移的耐药机制。结果显示:190株大肠杆菌的mcr-1检出率为36.84%,75.71%mcr-1阳性菌株中同时检出ESBLs基因,主要以blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14为优势基因;mcr-1阳性菌对氨曲南(ATM)、头孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐药率极显著高于mcr-1阴性菌(P<0.01);质粒转移率为47.14%,其中获得mcr-1和ESBLs基因共转移的接合子表现出与供体菌相同的耐药表型及耐药基因。综上,在四川省食品动物源大肠杆菌中,mcr-1与ESBLs基因共存现象广泛存在,且耐药基因易发生水平传播,对菌株多重耐药性的产生具有重要意义。

为将外源基因导入小单孢菌,建立小单孢菌(Micromonospora)与大肠杆菌两亲接合转移方法,将包含小单孢菌内源质粒pJTU112复制区的4.7kb片段插入质粒pOJ260的BamHⅠ酶切位点,构建了能在大肠杆菌和小单孢菌中复制的穿梭载体pSCU207,将质粒pSCU207转化大肠杆菌ET12567/pUZ8002,再与小单孢菌LXH20进行两亲接合转移,挑取接合转移子,并进行验证。结果表明:质粒pSCU207通过大肠杆菌与小单孢菌新鲜菌丝之间接合转移导入小单孢菌中,并可稳定遗传;大肠杆菌与小单孢菌新鲜菌丝之间的最佳接合转移体积是40μL和400μL。

[目的]了解福建省猪源mcr-1基因阳性细菌的流行性、耐药特性及分布特征。[方法]从福建省7个地市的21个猪场采集313份粪便样本,应用PCR方法筛选、分离和鉴定mcr-1基因阳性细菌;采用K-B琼脂扩散试验进行药敏检测,分析mcr-1基因阳性细菌的耐药性,并使用PCR方法分析其耐药表型;进一步采用多位点序列分型(MLST)方法鉴定mcr-1基因阳性大肠杆菌的类型,使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析方法对mcr-1阳性大肠杆菌进行聚类分析,探明其分布特征和亲缘关系。[结果]从313份猪粪便中共分离获得43株mcr-1基因阳性细菌,其中大肠杆菌39株。耐药性结果显示,分离菌株对磺胺甲基异恶唑、氟苯尼考、链霉素、强力霉素、恩诺沙星、新霉素、阿莫西林、头孢噻肟、林可-壮观、亚胺培南、呋喃妥因、利奈唑胺和替加环素的耐药率分别为90.1%,83.7%,74.4%,67.4%,67.4%,58.1%,53.5%,39.5%,34.9%,11.6%,4.6%,0和0。磺胺类耐药基因中的sul1、sul2和sul3基因检出率较高,分别达到81.4%,90.7%和74.4%;喹诺酮类耐药基因中仅有qnrS和aac (6')-Ib-cr被检出,其检出率分别为51.2%和30.2%;氯霉素类耐药基因中Cat2和cmIA基因的检出率较高,分别达到86.0%和74.4%;氟苯尼考耐药基因(floR)的检出率为83.7%;金属β-内酰胺酶耐药基因(NDM-1)的检出率为23.2%;多药耐药基因(cfr)的检出率为7.0%;而替加环素耐药基因(tet(X))未被检出。39株mcr-1基因阳性大肠杆菌除了4株不能分型外,其他35株共分为19个ST型,具有高度多样性,其中ST10为优势型,共有9株菌株。PFGE图谱显示,39株mcr-1基因阳性大肠杆菌共获得30种PFGE谱型,具有多态性特征,分为6组克隆群。[结论]福建猪源mcr-1基因阳性细菌主要为大肠杆菌,少部分为肠杆菌科其他菌株,且分离菌株具有明显的多重耐药性;mcr-1基因阳性大肠杆菌在地域分布上具有多态性和高度多样性特点。

为研究耐黏菌素大肠杆菌的噬菌体治疗方法，本研究以耐黏菌素大肠杆菌为宿主菌，采用双层琼脂平板法从山东烟台某养鸡场污水样中分离纯化得到裂解性噬菌体SDYTW1-F1-2-2。通过透射电镜观察，最佳感染复数，一步生长曲线，温度稳定性，酸碱度稳定性等生物学特性测定，并对其进行全基因组测序分析。结果表明：1）噬菌体SDYTW1-F1-2-2噬菌斑呈现透亮，外周无晕圈，形态学观察显示其具有可伸缩性尾鞘。2）生物学特性分析表明，噬菌体最佳感染复数为0.1，潜伏期为50 min，爆发期为40 min，爆发量为（331±9）PFU/cell。在温度4～40℃，pH为4～12的环境下，噬菌体活性较为稳定。3）通过噬菌体全基因组测序及核酸类型鉴定显示，该噬菌体基因组全长为74 752 bp，双链DNA,GC含量42.1%。在噬菌体基因组中共鉴定出121个编码蛋白（CDS），包括结构组成、DNA代谢与复制和包装以及细菌裂解相关的功能基因，发现一个tRNA基因，且未检测到如stx-1等致病性基因和mcr-1等耐药基因相关的基因。综上，噬菌体SDYTW1-F1-2-2裂解谱较宽，具有良好的酸碱性、热稳定性以及安全性。本研究为后续开展针对耐黏菌素大肠杆菌的噬菌体治疗研究提供依据。

为探究罗伊氏菌素对大肠杆菌抗菌活性的分子机制，本研究通过产罗伊氏菌素罗伊氏乳杆菌ATCC 55730的摇瓶发酵及甘油诱导制备获得罗伊氏菌素，比较了其在不同温度条件下的稳定性，并分析了其对8种标准病原菌的抗菌效果。利用大肠杆菌K-12全基因敲除文库Keio系统，对其抗菌活性功能基因进行了筛选，并探讨了其抗菌活性的分子机制。结果表明，菌株ATCC 55730经甘油诱导及发酵制备所罗伊氏菌素的浓度为26.13 mmol·L^-1，其在不同温度条件下（-20 °C、25 °C及37 °C）均表现出良好的产物稳定性。罗伊氏菌素对5种亚型产气荚膜梭菌、沙门氏菌LT2、白色念珠菌及产肠毒素大肠杆菌K-88的最小抑菌浓度（MIC）分别为0.52～1.83、1.12、1.67及0.79 mmol·L^-1。从Keio系统中筛选获得了60个罗伊氏菌素抗性基因及69个敏感基因，其中两个关联核心基因cyaA及yheS分别与细胞膜通道蛋白及药物外排泵形成有关。由此推测，上述两个通路可能是罗伊氏菌素抗菌活性的关键分子作用靶点。本研究为揭示罗伊氏菌素的抗菌机制并推动其实际应用提供了科学参考。

【目的】对临床分离的宠物源大肠杆菌进行质粒介导喹诺酮类耐药基因qnrD的检测,并对该基因进行序列分析和传播机制的研究。【方法】采用微量稀释法对阳性菌株进行15种抗生素的最小抑菌浓度试验;通过PCR对基因克隆,并对克隆产物和菌株阳性质粒进行转化;同时对菌株进行接合转移试验。【结果】从164株宠物源大肠杆菌中检测出1株qnrD阳性菌株(GP2009-036),GP2009-036对14种兽医临床常用抗生素耐药严重,表现为多重耐药(14耐);PCR产物经连接PMD19-T载体后可转化入DH5α感受态细胞中;接合转移试验成功地将质粒转移到大肠杆菌J53中;可从GP2009-036与其转化子中抽提出阳性...

构建β半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶I(ST3GALI)基因的真核表达载体p IRES-ST3GALI,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达。以p GEM-ST3GALI质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增ST3GAL I基因,通过酶切和连接,构建真核表达载体p IRESST3GALI。经PCR、双酶切和测序鉴定正确后,转化筛选阳性重组大肠杆菌(DH5α),用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白,并用12%SDS-PAGE鉴定。结果表明,重组质粒p IRES-ST3GAL I中的ST3GAL I序列与原鸡的ST3GAL I氨基酸序列同源性98.8%,与猪的同源性达53.5%,与...

【目的】对广州分离得到的宠物源(主要是宠物猫、狗)大肠杆菌进行质粒介导喹诺酮类耐药PMQR基因qnr、qepA和aac(6′)-Ib-cr基因的流行性检测。【方法】采用琼脂平板稀释法对164株临床分离的宠物源大肠杆菌进行15种抗菌药物的最小抑菌浓度测定。通过PCR检测qnr、qepA和aac(6′)-Ib-cr基因。建立大肠杆菌基因指纹图谱并对指纹图谱进行分析。【结果】164株宠物源大肠杆菌对12种兽医临床常用抗生素耐药率较高,且表现为多重耐药(5-14耐)。在164株宠物源大肠杆菌中检测到3个菌株同时携带qnrA、qnrB和qnrS基因,其中2株也携带aac(6′)-Ib-cr基因。阳性菌株...

为探讨畜禽源大肠杆菌临床菌株产β－内酰胺酶及其基因特性，采用常规检测法检测菌株产β－内酰胺酶情况，ＰＣＲ法检测ＥＳＢＬＳ、ＡｍＰＣ基因型，质粒结合转移试验研究耐药基因分子传播机制，并使用微量肉汤稀释法检测供体菌及接合子的药物敏感性。结果显示：４６７株食品动物源大肠杆菌未检出产碳青霉烯酶和金属β－内酰胺酶，产ＥＳＢＬＳ和ＡｍＰＣ分别达３６．８３％和１３．７０％；１７６株产β－内酰胺酶菌株检出ＢＬＡＴＥｍ、ＢＬＡＣＴＸ－ｍ、ＢＬＡＯＸＡ、ＢＬＡＣＩＴ和ＢＬＡＤＨＡ分别为８４．０９％、６０．８０％、１４．７７％、３５．８０％和１．７０％；本次质粒转移率为５０％，多数转化子获得了供体菌的耐药性及耐药基．．．

为了解河南省质粒介导的喹诺酮类耐药基因(qnrA、qnrB、qnrS、qepA和aac(6′)-Ib-cr)在产16S rRNA甲基化酶鸡源大肠杆菌中的流行与分布,分别设计特异性引物对2005-2008年在河南省病鸡病料中分离保存的158株16SrRNA甲基化酶阳性鸡大肠杆菌进行PCR扩增。结果显示,在158株产16S rRNA甲基化酶鸡源大肠杆菌中,qnrA、qnrB、qnrS、qepA和aac(6′)-Ib-cr的检出率分别为0.6%,2.5%,13.9%,2.5%和58.2%。提示质粒介导的喹诺酮类耐药基因在河南省产16S rRNA甲基化酶鸡源大肠杆菌中普遍存在,且以qnrS和aac(6...

为给筛选肠毒素大肠杆菌(ETEC)抗病性的分子遗传标记提供依据,采用体外黏附测定大约克和沙子岭初生仔猪ETECF43种抗原型(ab,ac,ad)的黏附性,并进行了比较.结果表明,F4 ab黏附素对大约克猪和沙子岭猪均黏附强烈,而F4 ac则表现为不黏附;两个品种中均存在较高频率的F4 abR+-acR-;F4ad黏附素对沙子岭猪的黏附较强烈(0.400),而对大约克猪并不强烈黏附(0.242).上述结果也暗示,猪F4 ab受体和F4 ac受体存在较强的连锁,而与F4ad受体无此关系.

根据人源大肠杆菌 1型菌毛结构基因 (pilA)DNA序列 ,在其保守区设计了 1对带有 BamHI/Hind Ⅲ酶切位点的引物 ,经PCR扩增 ,从 2 4株鸡源大肠杆菌致病株染色体中得到 2 1个大小约 6 5 7bp的阳性产物 ,经酶切、连接、转化及筛选 ,得到 3种来自不同血清型鸡源大肠杆菌 (O1、O78及O88)PCR产物的阳性克隆。经核酸序列测定 ,确认所克隆的外源基因为 1型菌毛pilA基因

为了研究不同猪种(山东省地方猪种莱芜黑猪和引进猪种大约克)和FUT Ⅰ不同基因型仔猪对肠毒性大肠杆菌F18(ETEC F18)的抵抗能力和肠黏膜上皮细胞对ETEC F18黏附能力的差异,在采用PCR-RFLP技术对莱芜黑猪和大约克FUT Ⅰ基因型检测的基础上,选取易感性和抗性断奶仔猪,利用野生型ETEC F18标准株进行试验猪口服细菌攻毒试验和肠黏膜黏附试验。由于多方面原因,接受ETEC F18细菌攻毒的试验猪均未发病,无法判断试验猪对ETEC F18的抵抗能力。ETEC F18标准菌株能与所有FUT Ⅰ敏感基因型仔猪的小肠黏膜上皮细胞黏附,而不能与抗性基因型仔猪小肠上皮黏膜细胞黏附,莱芜黑猪...