【目的】含有AP2结构域的AP2/ERF蛋白是与植物抗逆性密切相关的转录因子家族,Soloist是AP2/ERF家族中的孤儿基因,大部分植物只有1个。克隆麻疯树该基因编码框的全长c DNA序列,并对其理化性质、基因结构、启动子区域调控元件、表达特性及蛋白原核表达进行分析,为深入开展麻疯树Soloist基因的功能鉴定及其在麻疯树遗传改良中的应用提供依据。【方法】利用AP2结构域的隐马尔可夫模型结合拟南芥与水稻的Soloist蛋白序列对麻疯树蛋白质数据库进行相似性检索,经过Pfam与CDD在线工具的验证获得麻疯树AP2/ERF基因家族成员。利用不同的工具对Soloist基因进行生物信息学对比分析。通过实时荧光定量PCR检测该基因在麻疯树不同器官及低温处理下的相对表达量。通过双酶切构建该基因的原核表达载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行IPTG诱导表达,分别收集不同诱导时间段的菌液,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况。【结果】共鉴定到119个麻疯树AP2/ERF家族基因,其中包含1个Soloist基因,命名为Jc Soloist。序列分析显示,麻疯树Jc Soloist基因编码框长度为699 bp,编码232个氨基酸,预测分子量为26.3 k Da,理论等电点为9.65,包含6个外显子与5个内含子。在其基因启动子序列中鉴定到TATA框、CAAT框,以及赤霉素、水杨酸及干旱等应答元件。表达分析显示,麻疯树Jc Soloist基因在麻疯树各器官中都有表达,但表达水平具有器官特异性,在根中表达量较高,而在叶片中表达量相对较低,同时,在叶片与根中都属于低温诱导表达基因,分别在低温胁迫3 h与24 h达到最大表达量,较对照提高34.38倍与3.83倍。构建了p ET-32a-Jc Soloist重组载体,且在原核细胞中稳定表达,SDS-PAGE结果显示融合蛋白分子量为46.0 k Da,与预期大小一致。【结论】麻疯树AP2/ERF基因家族鉴定到1个Soloist基因,包含由3条反平行β-折叠与1条α-螺旋组成的AP2结构域,与其他物种的报道一致。基因启动子区域鉴定到赤霉素、水杨酸等顺式作用元件,暗示该基因在麻疯树激素信号转导中发挥重要作用。Jc Soloist基因在麻疯树叶片与根中受低温诱导表达显著,说明该基因参与麻疯树低温响应过程以及低温信号转导途径,也成为麻疯树抗冷新品种选育的候选基因。

【目的】深入研究AP2/ERF基因家族在光皮桦Betula luminifera生长发育及环境胁迫响应中的生物学功能。【方法】利用光皮桦基因组数据，通过生物信息学方法开展AP2/ERF基因家族鉴定、基因特征、系统进化、基因结构、保守基序、順式作用元件、蛋白互作和表达分析。【结果】在光皮桦基因组中共鉴定到77个AP2/ERF基因，其编码的蛋白理化性质存在差异，大多数蛋白(60个)的理论等电点小于7.0。系统进化分析显示：这77个AP2/ERF转录因子属于5个亚家族，其中ERF亚家族最大，包含34个成员。光皮桦AP2/ERF各亚家族间的基因结构存在较大差异，其中AP2亚家族成员均具有6～9个内含子，而DREB亚家族基因则没有内含子；但AP2/ERF各亚家族内的不同成员具有相似的保守基序类型和分布。同时，AP2/ERF基因启动子上都存在大量与激素、调节、胁迫响应及生长发育相关的順式作用元件。此外，互作网络分析预测不同的光皮桦AP2/ERF亚家族蛋白间存在广泛的互作关系。进一步的表达分析显示：绝大多数光皮桦AP2/ERF基因(71个)的表达存在较强组织特异性，且在高温胁迫下，多数ERF或DREB基因的表达发生显著变化，表明ERF和DREB基因在高温胁迫应答中可能发挥着重要作用。【结论】通过生物信息学分析获得光皮桦77个AP2/ERF家族成员，分属于5个亚家族。不同亚家族基因具有相似的基因结构、保守基序等特征。基因启动子区含激素、胁迫响应等相关的作用元件。基因表达具有较强的组织特异性，且多数ERF或DREB基因对高温胁迫有明显响应。图6表1参39

植物在受到高温、低温、干旱和盐害等逆境胁迫时,ERF作为信号转导因子被诱导并调控其他抗逆基因的表达。研究茶树AP2/ERF-B3类转录因子在不同茶树品种间的分子特性、组织表达和逆境响应情况,将有助于了解AP2/ERF转录因子在茶树逆境调控中的作用。以2个茶树品种‘安吉白茶’和‘迎霜’为试验材料,通过RT-PCR方法分别从2种茶树的cDNA中克隆得到CsERF-B3基因。利用实时定量PCR技术检测该基因在茶树根、茎、叶、花各组织和4种非生物逆境胁迫处理(4℃低温、38℃高温、200 g·L-1PEG干旱处理、200 mmol·L-1NaCl)中的表达情况。结果表明:2种茶树中CsERF-B3基因...

【目的】克隆鸡纤维蛋白原样蛋白2(fibrinogen-like protein 2,FGL2)基因,并进行生物信息学分析和原核表达,为鸡FGL2蛋白的功能研究奠定基础。【方法】采用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术扩增鸡FGL2基因,克隆至pMD19-T载体,测序后对鸡FGL2基因及其编码的蛋白进行生物信息学分析。构建原核表达质粒pET-32a-FGL2,将其转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。【结果】成功克隆了鸡FGL2基因的CDS区,序列全长为1 320 bp,编码439个氨基酸。生物信息学分析显示,鸡FGL2氨基酸与火鸡、雉鸡、珍珠鸡、鹌鹑等禽类的同源性高,达96%以上;与哺乳类动物的同源性较低,其中与犬的同源性仅有64.8%。FGL2蛋白由439个氨基酸组成,理论分子质量为50.24 ku,分子式为C_(2 221)H_(3 451)N_(615)O_(673)S_(22),理论等电点(pI)为8.63,为不稳定的亲水性分泌型蛋白,无跨膜区。成功构建了原核表达质粒pET-32a-FGL2,其在大肠杆菌BL21(DE3)可表达以包涵体形式为主的FGL2融合蛋白,分子质量约为70 ku。【结论】成功克隆出了1 320 bp的鸡FGL2基因,明确了其编码蛋白的生物学信息,经诱导表达后获得FGL2重组蛋白。

【目的】桑树乳胶蛋白基因在抗虫防御过程中起着重要的作用。从桑树基因组数据库中鉴定桑树MLX56基因家族,并进行基因进化、基因结构及基因的表达分析,为桑树MLX56基因的功能研究及利用奠定基础。【方法】利用桑树基因组数据库,采用生物信息学方法,分析桑树MLX56基因家族结构及进化关系,并对MLX56基因家族成员进行鉴定;利用MEGA4.1软件进行系统进化树分析;通过半定量RT-PCR技术研究MLX56基因在桑树不同种及不同组织之间的表达水平,构建原核表达载体p ET-28a-MLX56-6,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导融合蛋白表达,分别收集不同诱导时间段的菌液,SDS-P...

以团头鲂为研究对象,扩增获得Junctophilin(Jph)家族4个成员,jph1a、jph1b、jph2和jph3的cDNA编码序列,分别为2 031、2 016、2 358和2361 bp,分别编码676、671、785和786 aa。团头鲂jphs均由5个外显子和4个内含子组成,与大多数物种的JPHs基因结构相似;结构域预测显示出8个MORN和1个TM结构域,且蛋白多序列比对分析显示Jphs在进化上非常保守。基于qRT-PCR(quantitative real-time PCR)分析显示,这4个基因呈现出组织特异性表达,其中jph1a、jph1b和jph2主要在肌肉和心脏中表达,而jph3主要表达于心脏、血液和大脑。在早期发育过程中,jph1a、jph1b、jph2和jph3的mRNA表达模式类似,分别在原肠胚期、心跳期和25 dph(days post hatching)达到高峰。综上研究结果表明,鱼类jphs基因在心脏和肌肉等组织中发挥重要作用,并且其功能可能不同于哺乳动物。

【目的】探究水稻AP2/ERF转录因子在叶片衰老中的功能及其受miRNA和组蛋白修饰调控的转录机制。【方法】在全基因组水平对水稻(Oryza sativa)AP2/ERF家族成员及其上游靶向的miRNAs进行鉴定和生物信息学分析。对miRNA及其靶基因在水稻叶片衰老过程中的表达谱进行分析。通过RT-qPCR检测该家族成员及miRNAs在水稻叶片衰老过程中的互作关系。【结果】在水稻中共有155个AP2/ERF基因，所有成员启动子都含有光响应元件，大多数基因都具有茉莉酸(jasmonic acid, JA)、脱落酸(abscisic acid, ABA)和厌氧诱导顺式作用元件。预测到45个miRNAs靶向调控水稻AP2/ERF家族的58个成员。鉴定出一系列在水稻叶片衰老过程中呈显著负相关的miRNA-靶基因对，暗示这些miRNAs可能通过抑制AP2/ERF基因的表达，参与水稻叶片衰老过程的调控。同时，发现4个AP2/ERF基因的表达量及其组蛋白H3K9ac富集水平随水稻叶片的衰老持续上升，说明这些基因表达同时受到H3K9ac修饰调控。【结论】在水稻叶片衰老过程中AP2/ERF基因的转录受其相应靶向的miRNAs和组蛋白H3K9ac修饰的影响。

以果叶兼用新桑品种‘嘉陵30号’的果实为材料,采用同源克隆法和抑制PCR法克隆桑树查尔酮异构酶基因(MaCHI)全序列。该基因的基因组序列全长2402bp,包含2112bp长的ORF和290bp长的3'UTR序列,ORF由4个外显子和3个内含子组成,该基因编码219个氨基酸。预测MaCHI编码蛋白质的分子质量为23.8ku,理论等电点为5.29。采用RT-PCR法分析MaCHI在不同组织中的表达水平,在叶片和果中的表达量较高,在根中表达量较低。构建pET-28a(+)-MaCHI原核表达重组质粒,并在大肠杆菌中诱导表达。

【目的】克隆短枝型苹果(Malus domestica Borkh.)的MdRGL基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为明确短枝型苹果MdRGL基因与短枝芽变特性之间的关系奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以短枝型苹果叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得短枝型苹果MdRGL的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。将克隆到的短枝型苹果MdRGL克隆到表达载体pGEX-4T-1上,构建融合表达载体pGEX-4T-MdRGL,转化到大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达。【结果】从短枝型苹果中克隆到5条MdRGL基因:MdRGL1a/b、MdR...

【目的】获得家蚕溶茧酶基因的全长序列,实现溶茧酶基因在大肠杆菌中的融合表达。【方法】利用cDNA末端扩增技术(RLM-RACE)克隆了家蚕溶茧酶基因cDNA序列(GenBank登录号:EF428980)。【结果】家蚕溶茧酶基因cDNA序列全长1047bp,其中780bp的蛋白质编码区可编码260个氨基酸,预测蛋白质分子量为27.6kD,等电点(pI)为8.89。家蚕溶茧酶基因包含4个内含子。用Signal P3.0Server程序分析家蚕溶茧酶基因,预测其从第1～22位为信号肽序列。SMART分析结果预测其第34～254位氨基酸序列具有类胰蛋白的丝氨酸蛋白酶活性。重组质粒pET-32a-Coc...

【目的】进一步了解AGL9转录因子基因的功能,以及该基因对茶树花器官形成与发育的作用。【方法】前期研究茶树正常花与不育花转录组差异时,筛选出一条与AGL9基因高度同源的基因序列,设计特征引物进行PCR扩增验证AGL9基因并对其生物信息学特征进行分析,同时运用qRT-PCR分析AGL9基因的特性表达。【结果】经验证AGL9基因含有1个726 bp的开放阅读框,编码242个氨基酸,预测分子量为27.67 kD,理论等电点为8.96,命名为CsAGL9。Blastn分析序列发现CsAGL9与多种植物AGL9蛋白具有高度同源性。保守基元分析表明,茶树CsAGL9具有MADS-box和K-box,属于E类功能基因。qRT-PCR分析CsAGL9在不育花的花瓣、雄蕊中的表达量高于正常花而雌蕊中的低于正常花。【结论】茶树CsAGL9基因对花瓣、雄蕊、雌蕊等花器官的形成和发育扮演重要的作用。

【背景】作为我国本土重要的资源昆虫，中华蜜蜂（Apis cerana cerana，简称中蜂）对我国初冬季低温开花植物的传粉具有重要的生态价值，其传粉习性与嗅觉系统密切相关。前期对中蜂采集蜂高、低温处理后的触角转录组数据分析发现，与昆虫嗅觉相关的尼曼匹克C2型蛋白（Niemann-Pick type C2 protein,NPC2）基因家族在低温时表达量上升。【目的】以中蜂NPC2家族基因为研究对象，克隆并分析其结构特征和表达谱以及高、低温处理下表达量的差异，为深入研究中蜂NPC2基因家族在中蜂低温适应的嗅觉感受功能提供参考。【方法】基于中蜂高、低温转录组测序结果，利用RT-PCR克隆获得中蜂NPC2基因ORF序列，进行系统进化树分析和三维结构预测，然后通过实时荧光定量PCR分析中蜂NPC2基因在不同发育时期、组织的时空表达谱，以及高、低温时的表达量变化。【结果】获得4个中蜂NPC2基因——AcNPC2a、AcNPC2b、AcNPC2c、AcNPC2d的ORF全长，分别为447、480、459和465 bp，编码148、159、152和154个氨基酸，预测蛋白分子量为16.12—18.53 kD，等电点分别为7.98、7.57、6.56和6.34。进化树分析显示AcNPC2与意大利蜜蜂的NPC2同源序列亲缘关系最近，与其他膜翅目昆虫NPC2也有一定相似性。实时荧光定量PCR结果显示，AcNPC2a在新出房蜂的腹部表达量最高，其次是在哺育蜂的腹部以及幼虫期；AcNPC2b在新出房蜂的胸部表达最高，在采集蜂的头部、胸部和后足也有表达；AcNPC2c在哺育蜂和采集蜂的触角中呈高丰度表达；AcNPC2d在采集蜂的头部表达量最高。经低温处理后，4个AcNPC2基因在采集蜂触角中的表达量均有所上升，但差异不显著。【结论】AcNPC2具有NPC2蛋白的保守结构，其基因家族成员在中蜂的时空表达谱中呈现多样性，其中AcNPC2c在触角中呈高丰度表达，表明其与中蜂嗅觉感受功能关系密切。AcNPC2基因家族在低温时采集蜂触角中表达量均有所上升，表明该基因家族有可能参与中蜂的低温适应性，或与初冬季访花行为有关。

【目的】YABBY是高等植物中特有的转录因子家族,在侧生器官发育和开花过程中发挥重要作用。本研究对毛白杨PtYABBY基因进行克隆和生物信息学分析,并对雌雄花芽8个关键发育时期和根茎叶等组织中PtYABBY基因表达模式进行探究,以期为阐明PtYABBY基因在毛白杨侧生器官发育过程中的功能奠定前期基础。【方法】以毛白杨为试材,采用同源基因克隆法从毛白杨中分离FILAMENTOUS FLOWER (FIL)/YABBY3 (YAB3)同源基因PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11的编码区序列,并开展生物信息学分析。通过qRT-PCR研究这3个基因在雌雄花芽8个发育时期及根、茎、幼叶、成熟叶片中的表达规律。【结果】PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11编码区长度分别为633、642、639 bp,分别编码210、213、212个氨基酸。所推测的氨基酸序列包含C_2C_2锌指结构域和YABBY结构域。系统进化分析进一步表明这3个基因属于FIL/YAB3亚家族成员。qRT-PCR结果显示这3个基因在根、茎、叶及8个时期雌雄花芽组织中均有表达,但PtYABBY基因间的表达水平存在明显差异。PtYABBY3表达水平在雌雄花芽发育初期下调,发育后期上调;花原基形成到休眠期内PtYABBY3在雌雄花芽中呈现相反的表达变化趋势。PtYABBY4和PtYABBY11基因在雌雄株成花诱导期表达水平最高,成花诱导到伸长期内呈现下降趋势,在雄花芽休眠期和小孢子发生期基因表达水平无明显变化。营养组织表达量测定结果显示这3个基因在幼叶和成熟叶片中表达水平相对较高,根系中表达量最低。【结论】YABBY基因家族成员PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11同属FIL/YAB3亚类,在毛白杨雌雄花芽发育的8个时期中表达水平存在较大差异,且在叶片和花芽中表达量较高,表明其可能与叶片和花芽发育相关。本研究为今后深入研究YABBY家族成员在杨树器官生长发育过程中的作用奠定基础。

为研究查尔酮合成酶基因(CHS)家族在‘无子瓯柑’ Citrus suavissima ‘Seedless’雄性不育发生过程中的作用,以克里曼丁橘Citrus clementina基因组数据库为参照,在‘无子瓯柑’和瓯柑Citrus suavissima的转录组和蛋白质组测序结果中筛选出4个CHS同源差异表达基因,并对其克隆和表达量分析,对克里曼丁橘CHS基因家族成员进行生物信息学分析。结果表明:‘无子瓯柑’和瓯柑CHS基因编码区核苷酸序列相似度达98%以上。小孢子母细胞发育各时期CHS基因表达量在瓯柑和‘无子瓯柑’间差异显著。与瓯柑相比,‘无子瓯柑’小孢子母细胞时期Ciclev10005133m, Ciclev10030093m和Ciclev10015535m的表达量显著下调;减数分裂时期Ciclev10005133m,Ciclev10001405m和Ciclev10015535m的表达量显著下调;四分体时期Ciclev10001405m和Ciclev10030093m的表达量显著减少。在花粉粒成熟时期的花蕾中,Ciclev10001405m与Ciclev10005133m在花药中特异性表达。CHS同源基因在花药不同时期中的差异表达可能是‘无子瓯柑’花药发育异常的重要原因,并最终导致‘无子瓯柑’雄性不育。图3表6参15

【目的】探究水曲柳光敏色素互作因子(FmPIFs)在激素调控与非生物胁迫应答过程中的重要作用,为揭示水曲柳抗逆分子机制和制定林木遗传育种策略提供理论依据。【方法】在水曲柳中克隆FmPIFs基因,并对其基因结构、蛋白质理化性质、保守基序、系统进化关系等进行生物信息学分析。采用qRT-PCR方法分析水曲柳中FmPIFs基因在不同组织及不同激素与胁迫条件下的表达模式。【结果】获得5个水曲柳FmPIFs基因家族成员,分别命名为FmPIF1、FmPIF3、FmPIF4、FmPIF7和FmPIF8,其对应的蛋白均为亲水性不稳定蛋白,全部定位在细胞核内。多序列比对结果表明FmPIFs均存在APB保守结构域,成员FmPIF1与FmPIF3存在特有的APA结构域。组织特异性分析显示FmPIFs均在叶中表达量最高,其中成员FmPIF8表达量最高,为对照的3.96倍;但在茎中少量表达,茎中表达量最高的是FmPIF3,仅是对照的0.21倍;而在根中表达量均极低。胁迫响应分析表明,FmPIFs正调控水曲柳植株盐、碱和干旱胁迫抗性,而对植株抗寒性起负调控作用,其中成员FmPIF3对寒冷及盐胁迫明显响应,FmPIF8在碱胁迫下表达量明显上调,FmPIF1在干旱胁迫下表达量明显上调。在激素响应结果中,FmPIFs对脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)和赤霉素(GA_3)的响应较为一致,而对生长素(IAA)和茉莉酸甲酯(MeJA)的响应存在差异。FmPIF1在施加MeJA后剧烈应答且表达量显著上调,FmPIF7在SA处理后表达量明显上调,FmPIF3和FmPIF4在GA3处理后表达量明显上调。【结论】FmPIFs各成员在基因及蛋白结构上表现出较高的一致性。RT-qPCR结果表明,FmPIFs在水曲柳叶片中表达量最高。在盐、碱、干旱和寒冷胁迫下,FmPIFs被诱导表达,且大部分表达模式相似。FmPIFs也在水曲柳响应IAA、ABA、MeJA、SA、GA3激素调控过程中发挥重要作用。