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[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
何诚 朱虹 王传武 何君 张浩杰 檀华 端青
利用鹦鹉热衣原体重组主要外膜蛋白 (MOMP)在大肠杆菌中的表达产物 ,纯化后与白油佐剂乳化成疫苗。对 3批疫苗物理性状、无菌试验、安全试验、最小保护剂量、效力检验、免疫期、保存期和田间试验等各项技术指标进行了测定。重组MOMP疫苗为乳白色油包水型疫苗 ,黏度为 8s·0 4mL-1;细菌培养阴性 ;10d肉鸡分别以5 0和 10 0 μg注射免疫后 ,观察 14d ,免疫鸡群除一过性发蔫外 ,临床采食、饮水 ,注射部位剖检无异常变化 ;以 2 5 ,5 0 ,10 0和 2 0 0 μg分别免疫肉鸡后 ,30d龄攻毒 ,发现 5 0 μg免疫组可以抵抗病原的攻击 ;选择每只 5 0 μg免...
关键词：
鹦鹉热衣原体 主要外膜蛋白 疫苗 肉鸡
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
郝永新 赵德明 杨建民 何诚
为快速检测鹦鹉热衣原体,基于鹦鹉热衣原体rrn操纵元序列(即16S-23S rRNA间隔区基因和23SrRNA基因序列)建立了双重PCR法,对100份临床标本进行检测,并与单一PCR法、免疫荧光法进行了比较。结果显示:双重PCR法特异性与敏感性均高于单一PCR法、免疫荧光法。双重PCR平均阳性检出率为83.4%~97.2%,敏感性为500 fg/μL。结果显示鹦鹉热衣原体rrn操纵元序列双重PCR法不仅能够检测衣原体和非衣原体感染,而且能够同时实现鹦鹉热衣原体检测和鉴定,从而克服了单一引物应用时的不足,为未来鹦鹉热衣原体病分子流行病学调查及临床早期诊断提供了有效的检测手段。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
袁吉磊 何诚 蒋毅 凌勇 杨君敬 张发明 李应超 陈曦
为探讨禽鹦鹉热嗜性衣原体PmpD基因的生物学功能,本实验根据禽类鹦鹉热嗜性衣原体Cal-10株全基因序列设计引物,用PCR法扩增禽嗜性衣原体PmpD基因N端区,将特异性目的基因片段克隆入PBS-TII载体,经测序后确认为目的基因,并提交GenBank。试验扩增的禽鹦鹉热嗜性衣原体Cal株PmpD基因与禽鹦鹉热衣原体6BC株的PmpD基因和氨基酸序列的相似性均达99%,与流产衣原体成员嗜流产衣原体S26/3株、嗜豚鼠衣原体(GPIC)、嗜猫衣原体(Fe/C-56)核苷酸相似性分别为89%、82%和77%。PmpD基因N端区基因亚克隆到pET-32a(+)载体上,重组表达载体转化BL21(DE3)...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
杨琪 李建平 杨建民 李军 杨利 何诚
为增强猪流产嗜性衣原体omp-1基因的免疫措施进而筛选出高效新型分子疫苗,本实验将猪流产嗜性衣原体omp-1基因克隆入pcDNA3.1(+)载体构建DNA疫苗,初次和二次免疫分别以核酸/重组蛋白(DNA/r-MOMP)、重组蛋白/核酸(r-MOMP/DNA)、重组蛋白+核酸/重组蛋白+核酸(r-MOMP+DNA/r-MOMP+DNA)、核酸+核酸(DNA/DNA)和重组蛋白+重组蛋白(r-MOMP/r-MOMP)5种组合接种BALB/c小鼠,同时以载体和弱毒为对照。二次免疫后14 d以ELISA和T淋巴细胞增殖实验检测特异性体液免疫和细胞免疫应答水平。结果显示核酸与重组蛋白同时免疫可以诱导产生...
[期刊] 水产学报
[作者]
黄浦江 黄郁葱 简纪常 吴灶和 鲁义善 张雪利
参照GenBank上登录的哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因序列,设计引物扩增OmpW的开放阅读框,序列分析结果显示该基因全长645 bp。将其定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌BL21中成功表达出带His-tag的融合蛋白,融合蛋白分子量约为43.8 ku,且主要以包涵体形式存在。优化的表达条件为37℃,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导时间5 h。将纯化的融合蛋白免疫SPF昆明小鼠制备多克隆抗体,ELISA方法检测抗体效价达1∶30 000,Western-blot结果表明鼠抗OmpW血清能与诱导后的重组蛋白发生特异反应,提示OmpW可能是哈维氏弧菌的一种重要保护性抗原...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
顾宏伟 陆承平
【目的】本试验以小鼠为动物模型,比较了兔多杀性巴氏杆菌铁调节外膜蛋白(IROMPs)的免疫原性及分析交叉免疫保护效果。【方法】分别以正常培养基和限铁培养基增殖兔多杀性巴氏杆菌C51-12和C51-3,采用Sarcosyl沉淀—超离法提取IROMPs和OMPs,并用SDS-PAGE比较两株之间的差异,同时用正常培养基增殖该菌制备灭活全菌抗原。免疫原性分析,将清洁级小鼠20只随机分成4组,5只/组,以C51-12株的全菌、IROMPs和OMPs作抗原分别免疫,采用间接ELISA检测免疫小鼠的相应抗体动态变化;免疫保护试验,分别采集经4次免疫后小鼠的抗血清,作1﹕10稀释腹腔注射小鼠,每组6只,18...
[期刊] 水产学报
[作者]
高磊 李健 王群 刘淇
利用Western-blot技术,对鳗弧菌L-18株的OMPs和IROMPs的免疫反应性进行了分析,并通过免疫牙鲆比较二者免疫保护力的差异,以期从IROMPs方向探索开发鳗弧菌新型鱼用疫苗,并为研究其免疫原理提供重要的科学依据。结果表明,培养基中加入不同浓度的联铁剂,鳗弧菌L-18株的生长和铁载体的表达出现规律性变化,其中加入100~130μmol.L-12,2′-联吡啶为最适合限铁条件,此时铁载体的表达量最高且生长受抑制程度较小。在此条件下,菌株表达出74.3 ku和77.4 ku的IROMPs,其中77.4 ku蛋白具有免疫反应性,为重要抗原。用全菌灭活疫苗、OMPs、IROMPs分别腹腔...
关键词：
鳗弧菌 铁调节外膜蛋白 牙鲆
[期刊] 中国农业科学
[作者]
顾沛雯 吴云锋 王海妮 安凤秋
【目的】探讨小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白在介体-病原-寄主互作的分子机理。【方法】通过植原体免疫膜蛋白基因序列两侧的保守区设计引物对Imp1051/Imp2265,用PCR方法扩增小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白基因;对扩增片段的最大开放阅读框和基因的同源矩阵、系统发育树分析;对克隆基因所编码蛋白进行跨膜区、亲疏水区和前导信号序列分析。【结果】从小麦蓝矮病病株和接种长春花中均扩增到约1.0kb的特异片段,其中小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白基因长495bp,推导的编码蛋白含有164个氨基酸。与10种植原体的免疫膜蛋白基因进行序列同源性分析,小麦蓝矮与三叶草绿变植原体同源性最高,核苷酸和编码的氨基酸序列的同源率分别...
[期刊] 水产学报
[作者]
黄志坚 何建国
利用初步制备的溶藻弧菌外膜蛋白(outer membrane protein ofVibrio alginolyticus,Va-OMP)、溶藻弧菌蛋白分子量58kD外膜蛋白(Va-OMP58)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus,Va)灭活菌苗、溶藻弧菌脂多糖(lipopolysaccharides ofVibrio alginolyticus,Va-LPS)菌苗等进行主动保护性和被动保护性的实验比较,Va-OMP、Va-OMP58免疫组小鼠免疫后用活菌攻击,免疫保护率为62.5%~86.7%,而Va-LPS组和Va灭活菌苗组的免疫保护率为50%~62.5%,对照组的免疫保护...
关键词：
溶藻弧菌 外膜蛋白 免疫原性 免疫保护性
[期刊] 水产学报
[作者]
姜倩雯 张丽珊 李小艳 武瑶 赵怡扬 徐慧铭 林向民
为了筛选细菌的疫苗候选蛋白，本实验根据课题组前期的研究发现，挑选了2个嗜水气单胞菌外膜蛋白（A0KLQ6和A0KH89）并以A0KHR9（OmpAII）为对照,比较外膜蛋白与碳纳米管载外膜蛋白，分别在腹腔注射与浸泡免疫模式对斑马鱼的免疫反应与免疫保护效果。结果显示，腹腔注射组和浸泡组与普通蛋白组对比，碳纳米管载蛋白能够显著提高斑马鱼免疫相关基因表达量。腹腔注射组在5 μg剂量下免疫A0KHR9、A0KLQ6和A0KH89蛋白分别获得61.6 %、65.39 %和84.96 %相对免疫保护率（relative immune protection rate，RPS），在5 μg剂量下免疫碳纳米管载蛋白SWCNTs-A0KHR9、SWCNTs-A0KLQ6和SWCNTs-A0KH89分别获得68.10 %、77.50 % 和90.43 %的RPSs。浸泡组在40 mg/L剂量下免疫A0KHR9、A0KLQ6和A0KH89蛋白分别获得30.80 %、25.85 %和37.80 % 的RPSs，在40 mg/L最高剂量下免疫碳纳米管载蛋白疫苗SWCNTs-A0KHR9、SWCNTs-A0KLQ6和SWCNTs-A0KH89分别获得63.60 %、73.74 % 和68.49 % 的 RPSs。研究表明，铁离子限制下嗜水气单胞菌外膜蛋白A0KLQ6和A0KH89等蛋白能够作为抗嗜水气单胞菌的亚单位疫苗候选蛋白，而单壁碳纳米管载蛋白通过注射免疫与浸泡免疫均能显著提升免疫疗效，是一种疫苗的适宜纳米载体。以上研究为寻找高效的嗜水气单胞菌亚单位疫苗候选蛋白及佐剂提供了理论依据。
[期刊] 海洋水产研究
[作者]
张伟妮 周丽 邢婧 战文斌
用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)抽提结合超速离心纯化的方法提取了溶藻弧菌SR1、鱼肠道弧菌HQ010223-1和鳗弧菌S010610-1共3株水产动物致病弧菌及其他11株水产动物主要弧菌和4株非弧菌属细菌的外膜蛋白(Outer membrane proteins,OMPs),通过SDS-PAGE分析其外膜蛋白的组成结构。结果表明,3株致病弧菌分别有12、6和6条外膜蛋白带,且分子量主要集中在32~48kD和66~106kD之间。同时,分析其他11株水产动物主要弧菌和4株非弧菌属细菌共15株细菌外膜蛋白的SDS-PAGE图谱发现,11株弧菌的外膜蛋白图谱比较相似,而与非弧菌属细菌爱德华氏菌...
[期刊] 水产学报
[作者]
王莹 汪浩 徐伟 汪玮 施慧 王庚申 谢建军 何杰 许文军
为评价大黄鱼杀香鱼假单胞菌外膜蛋白Tol C（GenBank：EPB97112.1）的免疫保护效果，通过原核表达获得重组的Tol C功能域蛋白，命名为B6。用兔抗杀香鱼假单胞菌多抗血清对B6进行免疫原性的初步检测。将B6与明矾佐剂混合制成亚单位疫苗，腹腔注射免疫大黄鱼，免疫4周后攻毒，检测相对保护率（relative percent survival，RPS）；同时，采集免疫后第2、4、6、8周的鱼血清和头肾、脾脏，测定血清抗体效价和免疫相关基因的表达变化；采集健康和攻毒后个体的头肾和脾脏，制成石蜡切片，观察组织病理变化。结果表明，B6分子量为22 ku。Western blot结果显示，杀香鱼假单胞菌兔抗血清与B6具有强结合条带。接种B6亚单位疫苗4周后，RPS达72.22%。ELISA结果显示，免疫后第2周起，血清抗体效价显著升高，第4周时达到峰值（log2 8.65），随后略有下降，第8周时降至log2 6.98。RT-PCR结果表明，免疫后第2、4、6、8周，头肾和脾脏中免疫相关基因均有不同程度的表达上调，其中IL-1β和MHC Ⅰ α的上调幅度最大，头肾中分别达到93.33倍和77.02倍，脾脏中分别达到241.13倍和131.95倍。除CD8外，IgM、IL-1β、CD4、MHC Ⅰ α、MHC Ⅱ β在脾脏中的表达上调幅度均高于头肾。石蜡切片显示，PBS对照组在攻毒后头肾和脾脏中出现严重的出血点和结节，并伴随不同程度的铁黄素沉积，B6免疫组在头肾和脾脏中仅有少量出血点，无结节和铁黄素沉积。综上，本研究对大黄鱼杀香鱼假单胞菌外膜蛋白Tol C进行了原核表达和免疫保护效果评价，结果表明B6具有良好的免疫原性，免疫后4周RPS达72.22%，具有作为亚单位候选疫苗的潜力。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
黄辉 毛芝娟 陈吉刚
根据已发表的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)外膜蛋白OmpU的基因序列设计1对特异性引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,自哈维氏弧菌致病菌株基因组中扩增获得一段约1 000 bp的序列,构建重组载体pMD18-T-OmpU;测序结果表明,该基因与已发表的哈维氏弧菌外膜蛋白OmpU序列存在98%以上的相似性,该序列在GenBank上的登录号为FJ919231。构建表达质粒pET-30a(+)-OmpU后转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3),在IPTG诱导下实现高效表达,SDS-PAGE显示重组蛋白分子质量约为41 ku,与预期基本相符。重组蛋白以包涵体形式表达。以脲素法得到...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
简思杰 晁嘉 孙薇 陈春琳 陆娟 刘勇 刘祥
【目的】旨在评价嗜水气单胞菌外膜蛋白AHA2991的免疫学功能，为探索嗜水气单胞菌渔用疫苗候选抗原提供理论依据。【方法】通过生物信息学分析AHA2991氨基酸序列，揭示不同菌株间的亲缘关系；分子克隆构建AHA2991表达菌株并确定最佳诱导条件；包涵体洗涤及SDS-PAGE切胶纯化获得AHA2991并免疫红鲫；Western blotting检测AHA2991红鲫血清的特异性与效价；ELISA模拟AHA2991红鲫血浆与嗜水气单胞菌的体外相互识别作用；酸性、碱性磷酸酶（ACP、AKP）测定与细胞吞噬作用评价AHA2991非特异性免疫功能；组织病理学切片探究AHA2991免疫对红鲫内脏的影响情况。【结果】AHA2991蛋白家族在不同菌株间具有同源性，不同菌株间亲缘关系较近，尤其在气单胞菌间亲缘关系更近；AHA2991的最佳诱导条件为：菌液浓度OD_(600) =1.0，IPTG终浓度0.1 mmol/L，在28 ℃下诱导8 h。红鲫AHA2991抗血清具有良好的特异性，其效价为1:800；体外AHA2991血浆对嗜水气单胞菌具有识别作用，滴度可达1:3 200；ACP、AKP指标及细胞吞噬作用均显示AHA2991激活红鲫非特异性免疫；组织病理学切片表明AHA2991免疫对红鲫内脏结构无影响。【结论】嗜水气单胞菌AHA2991具有良好的免疫原性，有望成为嗜水气单胞菌渔用疫苗的候选抗原成分。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
郑宗林 郑曙明 Delbert M.Gatlin Ⅲ 汪开毓
为评价嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)PDK06株外膜蛋白A(omp A)的原核表达产物是否具有抗原性及其对斑点叉尾(Ictalurus punctatus)的免疫保护力,根据Gen Bank上嗜水气单胞菌外膜蛋白omp A基因序列(Gen Bank登录号:AF146597)设计去信号肽引物,扩增获得一段约1 000 bp的序列,经鉴定正确后,构建重组表达质粒p ET-32a(+)-pomp A;然后将该质粒转入BL21(DE3)后用IPTG诱导表达,经纯化后得到pomp A重组蛋白;最后将pomp Aomp A蛋白与弗氏不完全佐剂(FIA)混合免疫斑点叉尾,评价...
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