为深入研究鹅催乳素受体(PRLR)的功能,构建了含鹅PRLR胞外域编码序列exPRLR的原核表达质粒exPRLR-pET-28a(+),通过转化E.coli Roster建立了稳定的原核表达系统,在IPTG诱导下获得了PRLR胞外域的重组exPRLR。以重组exPRLR为抗原免疫家兔,获得了兔抗鹅exPRLR的抗血清。Western blot分析证明该抗血清可特异识别由原核生物表达的重组exPRLR。进一步分析成年母鹅的组织蛋白,发现成年鹅中可能至少存在3种相对分子质量不同的PRLR蛋白异形体。

应用RACE-PCR技术,克隆了全长3159 bp鹅催乳素受体基因(gPRLR)cDNA。序列分析表明,cDNA含443 bp5-′UTR、2496 bp编码区(含终止密码子TAA)和220 bp 3-′UTR。比对鸡催乳素受体基因并将前330 bp看作第1外显子,则gPRLR基因可划分为14个外显子。推导的蛋白序列含831个氨基酸,与鸡、鸽及火鸡PRLR的同源性分别为87.7%、85.2%和84.8%,其N末端含24个氨基酸的信号肽,成熟蛋白含807个氨基酸。gPRLR mRNA在成年鹅睾丸、输精管、卵巢、输卵管、肾、大肠、小肠、脾组织中均有表达,其中以肾、睾丸、大肠及小肠中表达最为丰富。

【目的】制备灰茶尺蠖(Ectropis grisescens Warren)固醇转运蛋白(SCP)的多克隆抗体,并检测灰茶尺蠖SCP2蛋白在灰茶尺蠖不同组织中的表达情况,为进一步研究SCP2对胆固醇的转运和利用机制以及其生物学功能奠定基础。【方法】以灰茶尺蠖5龄1 d幼虫中肠cDNA为模板,应用PCR技术扩增得到EgSCP2片段,将EgSCP2目的片段连入pMD18-T载体后进行测序,利用DNAMAN软件分析该基因序列的准确性及编码蛋白的分子质量。以测序正确的EgSCP2基因片段为模板,扩增EgSCP2的开放阅读框,通过BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶连接到原核表达载体pET32a中,并转化大肠杆菌BL21 (DE3)进行原核表达,离心收集并超声波破碎菌体,取上清液和沉淀分别进行SDS-PAGE检测,在不同温度、不同IPTG终浓度条件下优化EgSCP2重组蛋白表达条件。经Ni-NTA树脂层析柱纯化得到EgSCP2重组蛋白。将该蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗EgSCP2血清抗体,采用间接ELISA方法测定了该血清抗体的效价,并通过Western blotting检测EgSCPx和EgSCP2蛋白在灰茶尺蠖不同组织中的表达情况。【结果】扩增得到EgSCP2基因开放阅读框(ORF)全长为441 bp,编码146个氨基酸,预测编码蛋白的分子质量为16 ku。优化蛋白诱导条件的试验表明,28℃、IPTG浓度为1.0 mmol/L时,EgSCP2重组蛋白表达量最高,该条件下通过大肠杆菌表达的EgSCP2重组蛋白分子质量约为34 ku,其大小与预期结果一致,且其在上清液和沉淀中均有表达。间接ELISA法检测结果表明,制备的兔抗EgSCP2抗体具有较好的灵敏度,效价达到1∶256 000。Western blotting检测结果显示,58 ku EgSCPx在5龄2 d灰茶尺蠖的表皮、脂肪体和中肠均有表达,且在中肠的表达量远高于表皮和脂肪体;16 ku EgSCP2仅在表皮和脂肪体中表达。58 ku EgSCPx蛋白在4龄和5龄灰茶尺蠖的幼虫中肠大量表达,在蛹期少量表达,在成虫期几乎不表达。【结论】纯化获得了EgSCP2重组蛋白,其最优表达条件为温度28℃、IPTG终浓度1.0 mmol/L;制备了高效价的灰茶尺蠖EgSCP2多克隆抗体,明确了灰茶尺蠖EgSCPx蛋白在不同组织中的表达规律。

【目的】克隆猪Jiv蛋白核心区的2 112bp的基因片段,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达和纯化,制备抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。【方法】利用RT-PCR方法,从猪脾脏组织RNA中扩增得到猪Jiv基因,将其克隆到pMD19-T载体并测序,以此为基础构建原核表达载体pET32a-Jiv,转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,利用IPTG诱导表达,获得大量包涵体形式的猪Jiv融合蛋白。通过镍离子螯合层析柱对表达的目的蛋白进行纯化,对纯化后的包涵体蛋白进行透析复性,以每只新西兰白兔400μg蛋白的初次免疫剂量和500μg蛋白的加强免疫剂量进行免疫,共免疫5次,采集血清,采用间接E...

用rcPL对6~8周龄的昆明小鼠进行免疫注射制备多抗,第3次加强免疫后第6天采集少许血清,用琼脂凝胶免疫扩散(AG ID)和间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体的产生情况;分娩后立即通过剖腹产的方法获得山羊胎盘组织,用获得的抗血清通过免疫组织化学(IHC)和间接荧光抗体试验(IFA)的方法定位胎盘催乳素。结果表明,琼脂扩散检测抗原浓度为100μg/mL,用ELISA中酶标仪检测450 nm处OD值,免疫血清与阴性对照的比值P/N为7.77;IHC和IFA显示胎盘催乳素在肉阜和子叶的双核细胞及单核细胞中表达。使用背部皮下多点注射的方法对昆明小白鼠进行免疫来制备重组山羊胎盘催乳素多克隆抗体是...

实验进行了青鱼(Mylopharyngodon piceus)Dazl基因的原核表达,兔抗青鱼源Dazl多克隆抗体的制备及抗体的特异性验证。首先将青鱼Dazl基因的编码区利用重组表达引物从pCS2-MpDazl质粒中扩增出来,经酶切后连接到pET-28a载体中,构建pET-28a-MpDazl重组表达载体。然后将pET-28a-MpDazl重组质粒转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,利用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得分子量为27 kD的Dazl重组蛋白。将纯化的Dazl重组蛋白作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,抗体的效价和特异性通过ELISA法和Western blot检测。结果:成功构建重组表达载体pET-28a-MpDazl;以0.5 mmol/L IPTG在37℃条件下诱导4 h可获得高效表达的Dazl重组蛋白;制备的兔抗青鱼Dazl多克隆抗体能够特异性识别原核表达Dazl蛋白、青鱼卵巢的内源Dazl蛋白以及细胞中过表达的Dazl蛋白,并证实了青鱼Dazl蛋白在性腺中表达的特异性。

抗苗勒氏管激素(anti-mullerian hormone,AMH),也称苗勒氏管抑制物质(mullerianin hibiting substance,MIS),为肽类生长因子,属于TGF-β生长和分化因子家族。为研究AMH对奥利亚罗非鱼性腺发育的作用,应用DNAstar软件分析罗非鱼AMH基因的抗原性,选择抗原性较强的22～243氨基酸作为目的片段构建了AMH的原核表达载体并进行融合表达。首先利用RT-PCR方法从性腺中扩增出长约663bp的目的序列AMH基因,克隆至T载体中,经酶切鉴定和序列测定分析确认序列的正确性后将此片段克隆到表达载体pGEX-5x-1中构建重组表达质粒pGEX-A...

为探讨玉米AGPL2在籽粒发育时期淀粉积累过程中的功能机制,通过AGPL2基因克隆和构建带有GST标签的原核表达载体PGEX-6 T-1-AGPL2,并利用大肠杆菌诱导表达体系,用0. 5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在28℃条件下诱导表达6 h后,GST-AGPL2融合蛋白能够得到高水平表达,然后利用GST(Glutathione S-transferase)标签蛋白纯化介质进行亲和层析纯化,能够得到质量较高的GST-AGPL2融合蛋白;利用纯化所得的GST-AGPL2重组蛋白免疫新西兰大白兔制备了AGPL2多克隆抗体,分离并纯化抗血清,然后用rTEV Protease去除抗原GST-AGPL2融合蛋白的GST标签,并用纯化后的AGPL2多克隆抗体进行Western Blot检测,结果发现,AGPL2多克隆抗体具有较高特异性和灵敏性,可用于检测纳克级抗原蛋白;并利用Western Blot方法研究了AGPL2蛋白在玉米不同组织和不同授粉时期胚乳中的分布和表达模式,结果显示,AGL2蛋白在玉米不同组织中的表达具有组织特异性,且在胚乳中含量最高。AGPL2蛋白在玉米胚乳不同授粉时期表达量先增加后降低,且在授粉中期达到最大值。其结果与玉米籽粒发育过程中淀粉的积累规律一致,说明AGPL2主要存在于玉米胚乳中,且可能参与淀粉的合成,也说明AGPL2多克隆抗体具有很好的特异性,能够识别玉米体内的AGPL2抗原。

为了解催乳素受体(Prolactin Receptor,PRLR)的基因序列及其在建鲤(Cyprinus carpio var.jian)渗透调节组织中的表达情况,采用同源克隆和末端快速扩增(rapid amplication of cDNA ends,RACE)的方法分离克隆了建鲤PRLR基因全长cDNA,得到2 440 bp的全长cDNA,包括1 821 bp的开放阅读框(ORF),213 bp的5′末端非编码区(UTR)以及406 bp的3′末端非编码区(UTR)。对该基因序列和推测的氨基酸序列进行同源性比对和系统分析显示:建鲤与其他硬骨鱼类该基因的氨基酸序列相似度在37.46%～87....

应用RACE技术克隆了青虾(Macrobrachium nipponense)的Hc基因全长cDNA序列,并对该基因序列特征进行了分析。青虾Hc基因cDNA全长2 235 bp,包括10 bp的5′末端非翻译区(UTR),2 074 bp的开放阅读框(ORF),151 bp的3′UTR,开放阅读框编码688个氨基酸。蛋白相似度比对显示,青虾血蓝蛋白含有典型的6个保守的铜离子结合位点。系统进化树分析表明,青虾Hc与脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)Hc聚在一起,具有最近的亲缘关系。荧光定量PCR检测显示,Hc基因在青虾不同组织中均有表达,其表达量在肝胰腺中最高;使用荧光定...

根据GenBank中猪SIRT1mRNA序列设计引物,使用杜大长商品猪大脑RNA经RT-PCR扩增得到猪SIRT1基因全长表达序列,通过Ω-PCR将SIRT1蛋白末端抗原表位序列插入载体pET-28a(+),在大肠杆菌中表达并纯化得到45ku大小的蛋白,以其免疫新西兰大白兔并制备出抗体滴度达212的多克隆抗体。结果表明,成功制备出可以特异性识别猪SIRT1蛋白的抗体。

精氨酸激酶(arginine kinase,AK)在调节无脊椎动物磷酸精氨酸与ATP之间能量平衡的过程中具有重要作用。在前期工作基础上,设计特异引物,以凡纳滨对虾肌肉组织cDNA为模版,克隆得到了1071bp的凡纳滨对虾精氨酸激酶的完整开放阅读框;将它克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上,转化BL21(DE3)菌株,经诱导后表达出GST-AK融合蛋白。以纯化的融合蛋白作为抗原免疫小鼠,制备多克隆抗血清,经检测该抗原与抗体识别良好。利用得到的抗体对凡纳滨对虾AK在蛋白质水平上的特异性表达进行分析发现,精氨酸激酶在对虾的肌肉、心脏、神经、血细胞和胃组织中具有高的表达量,而在眼柄、肝胰腺、鳃和皮肤...

为探索铜绿假单胞菌ＥＴＡ蛋白的免疫保护功能，采用分子克隆方法获得铜绿假单胞菌ＥＴＡ表达菌株；利用切胶纯化获得ＥＴＡ蛋白并免疫小鼠，制备ＥＴＡ蛋白多克隆抗体；用ＥＬＩＳＡ方法，检测出ＥＴＡ抗血清滴度达１∶８ ０００；蛋白质印迹分析结果表明，抗血清具有很好的特异性；小鼠免疫保护试验结果表明，ＥＴＡ对铜绿假单胞菌感染的保护率达５０％，显著高于对照组的免疫保护率。用ＤＮＡｍＡＮ软件对ＥＴＡ序列同源性进行分析，发现革兰氏阴性菌的同源性高于革兰氏阳性菌，铜绿假单胞菌种间的同源性高于其他种类细菌的同源性；用ｍＥＧＡ软件对ＥＴＡ的进化分析结果表明，不同血清型铜绿假单胞菌的亲缘关系高于其他细菌，据此可推测ＥＴＡ．．．

根据鸡的蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)基因序列进行抗原肽分析,选择含大片段抗原表位区约1 500 bp的一段基因(151 515 bp)设计一对特异性引物后进行RT-PCR扩增,并构建pET-32a(+)-PERK重组质粒,将其转化至BL21(DE3)感受态细胞中.优化诱导表达条件,纯化重组蛋白后免疫兔并制备多克隆抗体.PCR鉴定、酶切鉴定和测序结果表明,pET-32a(+)-PERK重组质粒构建成功.SDS-PAGE电泳鉴定结果表明,重组蛋白在1.0 mmol·L-1IPTG、25℃下诱导9 h时的

根据GenBank上其他物种的PPARγ基因序列设计兼并引物,从鲈肝脏cDNA中扩增得到鲈PPARγ基因cDNA序列1588bp,分析表明该基因的开放阅读框为1569bp,编码522个氨基酸,理论等电点6.06,分子量59.02ku。将鲈PPARγ氨基酸序列比对后发现与欧洲鲈同源性最高,为93.1%;与金头鲷的同源性为92.3%,与人同源性也达到为61.8%。用RT-PCR分析该基因组织表达模式,结果表明,鲈PPARγ主要分布于肝脏、鳃和脂肪组织。将鲈PPARγ开放阅读框1569bp序列克隆至原核表达载体pET-28a(+)构成pET-28a-PPARγ1569重组体,并转化大肠杆菌BL21(...