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[期刊] 中国农业科学
[作者]
陈阳 黄正洋 张扬 李欣钰 甄霆 吴宁昭 徐琪 陈国宏
【目的】克隆鸭维甲酸诱导基因I(retinoic acid inducible gene I,RIG-I),分析其不同结构域的功能。【方法】根据GenBank上公布的鸭RIG-I序列设计引物,利用RT-PCR克隆鸭RIG-I基因CDS(coding sequence)区,根据保守结构域预测结果,构建携带6*his组氨酸标签的不同结构域缺失突变体的真核表载体(RIG-I-Full、RIG-I-N和RIG-I-C),转染鸡胚成纤维细胞DF1,经RT-PCR、间接免疫荧光方法鉴定重组质粒在细胞中转录与表达;同时,利用RT-qPCR检测RLR抗病毒信号通路中的IFN-β、Mx1和PKR等下游基因的表达...
关键词：
鸭 RIG-I基因 克隆 RLR通路
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
陆秋萍 季锷 蒋明义
[目的]本文通过对水稻甘氨酸富集基因OsGRP1的研究,从分子角度及生理遗传角度分析其在ABA诱导的抗氧化防护中的作用,并探究OsGRP1是否影响植物抗氧化防护与植物细胞壁发育。[方法]克隆基因分别构建相应重组质粒,用酵母双杂交试验(yeast two-hybrid, Y2H)研究转录因子ZFP36是否与OsGRP1蛋白水平互作,并通过GST pull-down(glutamine-S-transferase pull-down)、免疫共沉淀Co-IP(coimmunop-recipitation)、双分子荧光互补试验(bimolrcular fluorescence complementation, BiFC)辅证互作的真实性。观察ABA和H_2O_2条件下不同时间处理野生型水稻幼苗后OsGRP1转录水平表达的变化情况,鉴定OsGRP1转基因材料并测定突变体中与抗氧化防护相关的CAT和SOD活性及OsCatB基因和OsSodCc2基因的表达量,利用遗传材料分析在干旱和氧化胁迫下的耐逆性。[结果]OsGRP1基因的CDS序列为642 bp,编码214个氨基酸。通过Y2H、GST pull-down、Co-IP、BiFC证实OsGRP1与ZFP36互作的真实性。ABA和H_2O_2等处理均可诱导OsGRP1基因的表达上调。超表达OsGRP1基因可以提高抗氧化防护酶CAT和SOD活性及诱导OsCatB和OsSodCc2基因上调表达,并且OsGRP1-OE水稻在干旱和氧化胁迫下的存活率明显高于野生型水稻,而OsGRP1-KO水稻在干旱和氧化胁迫下的存活率明显低于野生型水稻,证明超表达OsGRP1基因增强了水稻对干旱胁迫和氧化胁迫的耐受性。[结论]OsGRP1参与ABA诱导的抗氧化防护途径并增强了水稻对干旱和氧化胁迫的耐性。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李明娜 龙瑞才 杨青川 沈益新 康俊梅 张铁军
【目的】在已有的一条紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Zhongmu-1)盐诱导未知基因的EST序列基础上,克隆其(MsHB2)全长序列并分析其功能,以进一步了解其在紫花苜蓿中的耐盐调控机理。【方法】以先前获得的EST序列为基础设计引物,使用RACE法从紫花苜蓿中克隆得到MsHB2的3′和5′末端序列,经DNAMAN软件拼接后得到其全长序列。使用多种生物信息学软件对MsHB2的开放阅读框,编码蛋白等电点、分子量、疏水性、亚细胞定位、进化关系等进行预测分析。构建MsHB2的亚细胞定位瞬时表达载体,使用基因枪转化法将MsHB2与GFP在洋葱表皮细胞中融合瞬时表达并观察其亚细胞定位...
[期刊] 林业科学
[作者]
李强 卢孟柱 陈颖 韩一凡 田颖川
机械损伤或病虫害侵扰引起植物一系列防御相关基因的激活，其中一些是因伤诱导表达的．Ｂｒａｄｓｈａｗ等１９８９年报道了杨树Ｗｉｎ３基因家族中的一员，其编码产物类似于白薯和豆类胰蛋白酶抑制剂，并且是因伤诱导表达的。为了更全面的了解这一基因启动子在因伤介导表达中的作用，探讨其在基因工程用于控制外源基因表达的可能性，本文分别从欧洲黑杨（Ｐ．ｎｉｇｒａ）和美洲黑杨（Ｐ．ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ）中扩增出ｗｉｎ３基因启动子ＷＩＮＰ（７０５ｂｐ）和ＷＩＤＰ（７９１ｂｐ）．这两个启动子与来自大肠杆菌的ＧＵＳ基因融合，通过根癌农杆菌Ｔｉ质粒转化系统引入烟草中．证实了ＷＩＮＰ和ＷＩＤＰ控制的ＧＵＳ基因的表达不仅在损伤部位...
[期刊] 水产学报
[作者]
赵紫霞 张研 曹顶臣 孙昭宁 许建 徐鹏
为发掘适用于基因工程抗病育种的鱼类启动子,通过实时荧光定量PCR实验对鲤Rab GTP酶(Ras-associated binding-GTPases 1a3,Rab1a3)基因的表达模式进行了分析,证实该基因在鳃、头肾等与机体免疫防御功能密切相关的组织内转录水平较高,且免疫激活后转录显著增强,符合基因工程抗病育种所需的外源免疫基因转录模式。从鲤细菌人工染色体文库中,使用Rab1a3基因特异引物筛选获得包含该基因区域的文库克隆,测序获得该基因完整序列,以及上下游调控序列。通过生物信息学手段,预测到长度为1
关键词：
鲤 Rab1a3基因 启动子 免疫诱导
[期刊] 华北农学报
[作者]
李青 张宁 司怀军 吴家和
分析棉花盐胁迫相关的EST文库,设计特异性引物,利用RACE技术从棉花中克隆出苹果酸脱氢酶(Malatedehydrogenase,MDH)基因,命名为GhMDH。基因全长1 130 bp,最大开放阅读框1 014 bp,编码338个氨基酸,分子量为35.495 kDa,等电点pI=8.94。将该基因编码区插入到原核表达载体pET23b中,获得pET23b-GhMDH重组载体。利用IPTG诱导表达目标蛋白,发现通常条件下获得的重组蛋白以包涵体的形式存在。对诱导时间、IPTG浓度和温度等条件进行优化,结果表明,除了在28℃低温以下诱导的蛋白有少量为可溶,其他条件诱导的蛋白均以包涵体形式存在。为了...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
郭鹏 邢鑫 张万筠 姜健
【目的】对紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Zhongmu-1)stress-induced protein kinase gene 1(Ms SIK1)进行克隆与表达研究,了解该基因的分子机制及其应用。【方法】以紫花苜蓿叶片总RNA为模板,根据同源克隆设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得Ms SIK1的编码序列。利用同源性比对进行序列分析。通过SMART网站(http://smart.embl-heidelberg.de/)模拟该基因的蛋白结构。构建Ms SIK1的亚细胞定位瞬时表达载体,使用基因枪转化法将Ms SIK1与GFP在洋葱表皮细胞中融合瞬时表达并...
[期刊] 林业科学研究
[作者]
梁立雄 常英英 高亚南 王颜波 张伟溪 苏晓华 张冰玉
ＤＮＡ甲基化是植物基因组中普遍存在的一种的重要表观遗传学机制，对植物生长发育及进化起着重要的调节作用［１－２］。植物体ＤＮＡ甲基化的建立和维持受多个基因的协同调控，其中ＭＥＴ１（ＤＮ－ＭＴ１－ｌｉｋＥ ＭＥＴＨＹｌＴＲＡＮＳＦＥＲＡＳＥ １ ｇＥＮＥ）是在植物中最早分离出来的甲基化相关基因，编码ＤＮＡ甲基化转移酶１（ＭＥＴ１，ＭＥＴＨＹＴＲＡＮＳＦＥＲＡＳＥ１），该酶主要负责保持Ｃｇ位点的甲基化，通过ＤＮＡ甲基化作用影
[期刊] 淡水渔业
[作者]
王文青 朱小玲
采用RT-PCR和RACE末端扩增技术,从日本沼虾(Macrobrachium nipponense)卵巢组织中获得了5种不同构型的RXR基因cDNA序列。结果显示:RXR基因中MnRXRL2含有最长的开放阅读框(open reading frame,ORF),其全长1698 bp,编码337个氨基酸。对比5个不同构型的核苷酸序列,有四个不同的剪接位点,一个发生在5′端A/B区域,产生了3种不同形式的5′端序列;一个在RXR受体结构的D区即铰链区域,使T-盒区长度也有3种形式(VQEERQR/VQVGGIEEERQR/VQVGGIE);两个发生在LBD区,其中一个是在H2-H3螺旋区域,产生了...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
翟军军 窦永喜 张海瑞 毛立 蒙学莲 骆学农 才学鹏
【目的】对小反刍兽疫病毒P基因进行克隆,并对其结构和功能的关系进行分析,为研究小反刍兽疫病毒P蛋白的功能及其在病毒增殖过程中的作用奠定基础。【方法】利用RT-PCR的方法对小反刍兽疫P基因全长进行克隆,通过生物学软件对其核苷酸序列和氨基酸序列进行了比对,利用I-TASSER进行三级结构预测,然后分析其结构和功能之间的关系。【结果】P基因和MV、CDV、RPV、DMV和PDV的P基因的相似性分别为62.9%、63.3%、64.4%、65.1%和60.4%,氨基酸的相似性分别为45.9%、46.2%、50.6%、50.3%和47.0%。三级结构表明该蛋白由3个结构域构成,中间是由多个α-螺旋构成的...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
赵黎明 佘媛 刘春林 阮颖
利用已构建的甘蓝型油菜种子发育过程SSH文库,筛选得到1个含MATH结构域的EST序列,并以其为信息探针,经电子克隆获得了该基因的全长cDNA,命名为BnaMT-1。BnaMT-1的开放阅读框(ORF)全长1 209 bp,编码402个氨基酸,相对分子质量为46 130.7,预测的理论等电点为8.50,其结构包括信号肽、跨膜结构及2个连续的MATH结构域,为亲水性胞外分泌蛋白;进化树分析发现,该基因与拟南芥含MATH结构域基因亲缘关系较近;利用半定量RT-PCR技术对该基因在甘蓝型油菜湘油15号不同组织及种子不同发育时期的表达分析表明:BnaMT-1在叶、花和果荚中都有表达,在根和茎中没有表达...
关键词：
油菜 MATH结构域基因 克隆 表达分析
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
周露 刘杨 崔群香 陈火英
[目的]本文旨在探索茄子SmICE1(Inducer of CBF expression 1)基因在低温响应和花青素合成途径中的功能。[方法]以光敏型茄子品种‘蓝山禾线’为材料，通过同源克隆获得SmICE1基因的全长序列，并对其进行生物信息学分析；4℃低温处理4叶期的茄子幼苗，分析SmICE1基因的表达水平；构建植物表达载体PHB-SmICE1-YFP,通过农杆菌介导法在烟草叶片中进行瞬时转化，研究SmICE1蛋白的亚细胞定位；通过农杆菌蘸花法在拟南芥中过表达SmICE1基因，分析转基因植株的耐寒性、生理指标及AtCBF(CRT binding factor)基因表达情况；将PHB-SmICE1-YFP农杆菌和SmCBFpro-LUC农杆菌菌液瞬时共转入烟草细胞中进行双荧光素酶试验；构建诱饵载体SmYABBY-pGBKT7和猎物载体SmICE1-pGADT7转化至酵母感受态AH109中进行酵母双杂交试验；构建植物表达载体SmYABBY-nYFP和SmICE1-cYFP,利用注射法将其农杆菌转化至烟草细胞中进行双分子荧光互补试验。[结果]克隆获得茄子SmICE1基因，其含有1 524 bp的开放阅读框，编码507个氨基酸，预测相对分子质量为54.75×10~3,理论等电点为5.6。多序列比对和进化树结果显示SmICE1与番茄SlICE1同源关系最近。荧光定量PCR表明SmICE1基因的表达受低温诱导。亚细胞定位显示SmICE1蛋白定位在细胞核中。SmICE1蛋白具有转录激活活性，双荧光素酶试验表明SmICE1可以促进SmCBF的表达。在拟南芥中异源过表达SmICE1基因可以增强植株的抗寒性。低温处理后，转基因植物的脯氨酸含量和AtCBF基因的表达量高于野生型，而电解质渗透率低于野生型。酵母双杂交和双分子荧光互补试验表明SmICE1与SmYABBY蛋白存在相互作用。[结论]SmICE1可以诱导SmCBF表达并增加转基因植株的抗寒性，SmICE1与SmYABBY互作可能参与调控茄子花青素生物合成。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
何学高 赵爱国 谢冬冬 黄晓华
【目的】克隆漆树(Toxicodendron vernicifluum(Stokes) F. A. Barkl.)叶片中的谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)基因并分析其结构特征,明确该基因编码蛋白的酶活性及该基因的抗逆性,为其功能研究提供理论依据。【方法】根据已有的漆树叶片转录组数据,利用RT-PCR克隆漆树GST基因,应用生物学网站对其所编码蛋白的理化性质进行分析,并构建系统进化树和三维结构模型;利用原核表达系统和Ni-NTA亲和层析技术表达、纯化漆树GST重组蛋白,并利用不同底物测定重组蛋白的酶活性;将原核表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3),验证该基因对低温、高温、高盐、高渗透压等非生物逆境胁迫的耐受性。【结果】获得了漆树谷胱甘肽S-转移酶基因TvGST7(GenBank登录号为MK956145)的完整编码序列,开放阅读框为711 bp,编码236个氨基酸,分子质量为27.17 ku,理论等电点为5.25;进化树分析和三维结构模拟表明,TvGST7蛋白属于Lambda(L)亚家族。酶活性测定结果显示,重组蛋白TvGST7具有巯基转移酶活性;胁迫试验表明,TvGST7的表达能增强大肠杆菌对低温、高温、高盐、高渗透压等非生物胁迫的抗性。【结论】根据TvGST7重组蛋白具有巯基转移酶活性及TvGST7的表达提高了大肠杆菌对非生物胁迫的抗性,推测TvGST7基因在漆树中的表达对于维持漆树体内的正常代谢和清除非生物胁迫产生的氧化损伤起着重要作用。
[期刊] 华北农学报
[作者]
李孟军 史占良 郭进考
为了探讨转录因子在小麦抗旱分子机制中的作用,利用Affymetrix小麦表达谱芯片对渗透胁迫下普通小麦(石麦15)根系和叶片诱导表达谱进行了分析。在表达谱芯片上筛选到1个渗透胁迫诱导表达的MYB转录因子EST序列(GenBank登录号:BJ264503)。根据该EST序列设计引物筛选石麦15基因组BAC文库,获得1个含有该EST序列的BAC单克隆。以BAC单克隆质粒为模板,通过BAC测序克隆了小麦MYB转录因子基因(TaMYBSM151)及其5'侧翼序列。TaMYBSM151的开放读码框长936 bp,编码1个含有311个氨基酸的R1-MYB转录因子。TaMYBSM151基因包含3个外显子和2...
关键词：
小麦 MYB转录因子 渗透胁迫诱导基因
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