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[期刊] 中国农业科学
[作者]
赵丹丹 杨国平 刁有祥 陈浩 提金凤 张璐 张英 李川川
【目的】鸭瘟（ＤＰ）是由鸭瘟病毒（ＤＰＶ）引起的一种急性、败血性传染病，以头颈肿胀、食道黏膜和泄殖腔黏膜出血、黄白色溃疡，头颈部皮下有黄白色胶冻样渗出为特征。该病一旦发生，发病急、死亡快、死亡率高，对养鸭业危害严重。快速诊断是控制鸭瘟的重要措施之一，可以及时确定病原，以便采取有效的防制手段。试验旨在建立鸭瘟病毒（ＤＰＶ）胶体金快速检测方法。【方法】利用生物学软件Ｐｒｏｔｅａｎ分析，选择鸭瘟病毒抗原表位较多的一段序列设计引物，ＰＣｒ扩增目的基因。连接到载体ＰＭＤ－１８ｔ上，测序正确后再连接到原核表达载体Ｐｅｔ－２８ａ上。将获得的重组质粒转化至ｒｏｓｅｔｔａ感受态细胞中进行诱导表达。表达的蛋白经纯．．．
[期刊] 淡水渔业
[作者]
夏武强 胡叶军 孙琛 张美珍 王伟萍 桑丽雅
通过研究胶体金免疫层析技术，建立了一种快速检测水产品中甲基睾酮含量的方法。将待测样品中的甲基睾酮和试纸条检测线上包被的人工抗原（ＭＴ－ＢＳＡ）竞争性结合金标结合垫上包被的胶体金－甲基睾酮单抗聚合物，根据检测线呈现的红色线条深浅来判定样品的阴阳性。结果显示：试纸条上ＭＴ－ＢＳＡ抗原工作浓度为１．０Ｍｇ／Ｍ Ｌ，羊抗鼠二抗工作浓度为１．５ Ｍｇ／Ｍ Ｌ，试纸条的最低检测限达到１０μｇ／ｋｇ，与甲基睾酮类似物的交叉反应率低；使用甲醇提取，４倍ＰＢＳＴ稀释，整个检测所需时间仅１０～１５ Ｍｉｎ，适用于大规模样品筛选。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
樊海新 李寒松 李复辉 马良友 朱平 吴金节 王希春
[目的]建立用于快速检测伏马菌素B1(FB1)的胶体金免疫层析试纸条。[方法]首先制备了FB1单克隆抗体和FB1-OVA偶联抗原,然后将FB1单克隆抗体与胶体金制成金标抗体包被在金标垫上,将FB1-OVA抗原和羊抗鼠Ig G包被在硝酸纤维素膜(NC膜)表面分别作为检测线和质控线。采用间接竞争法检测待检样品中的FB1与NC膜上的FB1-OVA抗原竞争结合金标抗体中的FB1单克隆抗体情况,并以检测线和质控线显示检测结果。[结果]本试验优化了金标抗体、检测抗原及羊抗鼠Ig G的包被量,检测FB1的灵敏度可达到2 ng·m L-1,最佳判定质量浓度为40 ng·m L-1。[结论]本试验制备的检测试纸...
[期刊] 水产学报
[作者]
辛志明 樊海平 吴斌 张新艳
采用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体分泌细胞株,获取抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体,柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金颗粒,选择直径20 nm的胶体金颗粒,标记抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体并制备胶体金垫。将胶体金垫与喷涂有抗豚鼠气单胞菌兔多克隆抗体和羊抗鼠抗体的硝酸纤维素膜及样品吸收垫等组装成免疫层析试纸条,建立豚鼠气单胞菌的快速检测方法。用灭活细菌与血清混合的模拟样本测定试纸条的特异性、灵敏度,结果显示,试纸条对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌等13种常见病原菌没有交叉反应,与豚鼠气单胞菌显示特异性反应,检测灵敏度为1×106CFU/mL,结果显示时间小...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
聂雯莹 罗晓琴 李金超 李行 吴广 王琳琛
【目的】苯乙醇胺A为一种新型违禁添加剂,目前的检测方法繁琐耗时,故建立动物尿液中苯乙醇胺A胶体金免疫层析快速检测方法。【方法】通过苯乙醇胺A与溴代戊醛发生亲核取代反应,制备得到苯乙醇胺A半抗原,将苯乙醇胺A半抗原与载体蛋白偶联得到免疫原和包被原,经TNBS法测定半抗原与载体蛋白偶联比。用免疫原免疫BALB/c小鼠,制备特异性单克隆抗体,采用间接竞争ELISA方法测定单克隆抗体的灵敏度。选取与苯乙醇胺A结构类似的13种同类药物利用间接竞争ELISA方法进行单克隆抗体特异性的测定,计算交叉反应率。并通过胶体金、单克隆抗体-胶体金标记物、结合物释放垫、反应膜、样品吸收垫的制备以及试纸条的组装,建立了...
[期刊] 华北农学报
[作者]
胡世享 叶玲玲 肖妍 卓娜 王滕芬 汪琳 蒲静 陈培富 艾军
为建立一种用于快速检测赤羽病病毒抗体的竞争ELISA法。用AKV病毒免疫Balb/C小鼠，将其脾细胞与SP2/0细胞进行免疫融合，以获得抗AKV的单克隆抗体；利用Bac-to-Bac杆状病毒表达的SBV N蛋白作为诊断特异性抗原，山羊抗鼠HRP-IgG为二抗，建立并优化AKV抗体检测的竞争ELISA方法。得到一株持续稳定繁殖的能够分泌单抗AKV核蛋白抗体的杂交瘤细胞株，单抗亚型鉴定为：重链IgG1,轻链kappa,仅能与AKV病毒呈阳性反应，与BTV、FAMD、EHDV病毒等病毒抗原不发生特异性反应；建立的检测AKV抗体ELISA检测方法，诊断抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,1∶1 000抗体稀释比，1∶50血清稀释比，1∶2 000二抗稀释比，封闭条件为5%BSA,37℃封闭2 h,确定了血清抑制率大于等于44%时为阳性，小于44%为阴性；所建立的ELISA方法敏感性和特异性鉴定结果与ID Screen AKV Competition检测试剂盒一致。本试验成功制备出一株分泌针对AKV N蛋白的杂交瘤细胞系，建立的ELISA检测方法能够用于检测动物AKV抗体，为进一步开展AKV抗体诊断试剂工艺研究、产业化奠定了基础。
关键词：
赤羽病 单克隆抗体 竞争ELISA
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
苏小东 曹瑞兵 张羽 刘文娟 陈昊 祝长青 陈溥言
鸭圆环病毒(DuCV)是新发现的一种感染鸭的最小病毒,可导致鸭淋巴组织损伤。目前尚无检测其抗体的商品化ELISA试剂盒。为了对鸭群进行DuCV血清流行病学调查,本试验用原核表达了全长DuCV Cap蛋白,Western blot检测证明表达产物具有良好的抗原性。以纯化的重组Cap蛋白作为包被抗原,应用30份DuCV抗体阴性血清和16份DuCV抗体阳性血清,建立了检测DuCV抗体的间接ELISA方法,以此方法对从江苏地区收集的部分鸭血清样品进行检测,结果显示DuCV抗体阳性率为26.7%(38/142)。试验证明该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,且方法的变异系数均小于10%。结论:该方法操...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
蒋韬 梁仲 陈涓 何继军 吕律 马维民 刘在新 刘湘涛
【目的】建立一种从田间样品中快速、灵敏、简便检测O、A、AsiaI型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法(GICA)。【方法】采用柠檬酸三钠还原制备胶体金颗粒,标记纯化的标准株O、A、AsiaI型口蹄疫抗体。将纯化的口蹄疫流行株O/China99,A/AF72and AsiaⅠ/China05抗体和羊抗豚鼠抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带。经试验条件优化,组装形成胶体金定型诊断试剂盒。【结果】本试验研制的口蹄疫定型试剂盒具有良好的灵敏度,可检测到7.8×104LD50(1﹕128倍稀释乳鼠毒)的病毒量。同时对阳性及阴性样品进行3次重复检测结果完全相同,说明其有较好的重复性;特异性...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张永强 吴晓东 刘雨田 张海涛 王志亮 鲍恩东
目的通过表达羊PrPc核心片段、单抗制备,最后建立免疫组织化学检测羊痒病方法。方法用PCR方法从小尾寒羊基因组DNA中扩增编码PrPc核心片段DNA,并克隆到硫氧还原蛋白融合表达载体pET-32a(+)上,转化至E.coliBL21,IPTG诱导融合表达。以纯化的重组小尾寒羊PrPc核心片段免疫PrPc基因敲除小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,制备羊核心片段单克隆抗体。结果通过上述方法,得到相对分子质量约为35kD的重组小尾寒羊PrPc核心片段,筛选出六株能稳定分泌针对小尾寒羊PrPc核心片段特异单抗的杂交瘤细胞株。免疫组化试验表明,其中4株可特异性识别羊痒病脑组织切片中耐PK酶消化的PrPsc,...
关键词：
小尾寒羊 痒病 单抗 免疫组化
[期刊] 水产学报
[作者]
高红艳 赵金龙 王雅晴 蒋秋燕 黄玉浩 林洪 李振兴
为实现甲壳类水产品主要过敏原的快速检测，实验使用凡纳滨对虾原肌球蛋白（TM）作为检测靶标，构建了胶体金免疫层析检测方法。使用天然TM分别免疫SD大鼠和新西兰大白兔制备多克隆抗体，以40 nm胶体金标记的鼠多抗作为检测抗体，以兔多抗为捕获抗体，基于双抗体夹心原理组装免疫层析试纸条，并应用于市售食物样品的检测。结果表明，组建的免疫层析试纸条可在5 min之内显示结果，视觉检出限为10 ng/mL，对虾、蟹、克氏原螯虾及美洲螯龙虾等甲壳类水产品的特异性高，但与蛤蜊、扇贝存在微弱的交叉反应；在不含甲壳类水产品的市售食品中的加标回收率为81%～126%，准确性良好；试纸条的批内、批间变异系数低于15%，市售实际食物样品的检测结果与食物过敏原标签一致。研究表明，该方法具有高灵敏度与检测特异性，可在多种基质与商业化食物样品中实现甲壳类过敏原的有效检测，具有较强的实际应用价值。
[期刊] 水产学报
[作者]
潘莹 杨家辉 彭发永 黄友华 秦启伟 黄晓红
为建立一种快速灵敏、可视化的适用于临床样品检测新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)的方法，本研究针对SGIV特异基因ORF014L序列设计特异性引物及探针，建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术及结合侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)(RPA-LFD)的SGIV检测技术。RPA反应使用10μmol/L的引物浓度，在40.1°C恒温反应20 min即可完成特异性病毒的检测，最低检测限为10~2个/μL标准质粒。RPA-LFD反应在42°C恒温反应8 min可将检测结果通过试纸条可视化呈现，最低检测限为10~1个/μL标准质粒，且不与其他常见水生动物病原发生交叉反应，临床样品检测结果也与PCR检测结果一致。RPA、RPA-LFD均能特异性检测SGIV，两者的检测限均比常规PCR灵敏。RPA-LFD法具有快捷简单、结果可视化的特点，在临床应用具有较好的应用前景。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
赵守山 颜世敢 朱丽萍 崔道实
用摩尔比100∶1的化学交联剂SPDP分别将RPE、抗猪瘟病毒抗体衍生,两种衍生物再以摩尔比1∶1液相交联,HPLC纯化制备出RPE标记的抗猪瘟病毒荧光抗体。对制备的荧光抗体从荧光特性、抗体活性、稳定性及纯度等方面进行鉴定。以溴化氰活化的琼脂糖微球为固相载体,采用固相免疫荧光检测法,以制备的RPE、FITC分别标记的荧光抗体检测猪瘟病毒细胞毒。结果表明,RPE标记的荧光抗体检测阳性微球在蓝绿光激发下发射桔黄色荧光,荧光明亮,无本底光干扰,检测灵敏度高达2.67×10-6mg.mL-1,是FITC标记的荧光抗体检测灵敏度的10倍。RPE可替代FITC或与FITC等荧光染料一起用于多色荧光免疫检测...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
赵丹丹 刁有祥 杨国平 陈浩 提金凤 张璐
【目的】制备鸭瘟病毒（ＤＰＶ）ｇＢ蛋白单克隆抗体，为建立ＤＰＶ快速诊断方法及进一步鉴定ＤＰＶ的抗原表位奠定基础。【方法】克隆ＤＰＶｇＢ基因，构建其表达载体并进行原核表达，纯化ＤＰＶ ｇＢ蛋白，以其作为抗原免疫８周龄ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合，进行间接ＥＬＩＳＡ及亚克隆筛选，并对单抗亚类及抗原性进行鉴定。【结果】ＰｃＲ扩增出９１５ＢＰ的目的基因，成功连接于ＰＥＴ－２８Ａ载体，并转化大肠杆菌ＲｏＳＥＴＴＡ进行诱导表达，获得４株稳定分泌抗ＤＰＶ ｇＢ蛋白的杂交瘤细胞株，分别命名为Ａ８Ｄ７、Ｅ６ｃ３、Ｈ１１Ｆ８、Ｈ６Ｆ６，间接ＥＬＩＳＡ检测其腹水效价分别为１∶１０３、１．．．
关键词：
鸭瘟病毒 gB蛋白 单克隆抗体
[期刊] 西南农业学报
[作者]
卢训 方琦 尹跃艳 秦西云 丁铭
用RT-PCR从感染烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的烟草样品中克隆该病毒的外壳蛋白基因,病毒外壳蛋白基因再亚克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,构建成重组原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导、Ni+NTA亲和柱纯化获重组蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔,制备TMV外壳蛋白多克隆抗体,并用制备的多克隆抗体建立了更简便、经济、特异性更强的DOT-ELISA检测法。
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
黄巧莲 金庆日 章先 周一媚 陈彦永 徐露凝 杨永春 程昌勇 田广燕 桂海娈 方维焕 宋厚辉
针对霉菌毒素精准检测技术的开发对于保障食品安全至关重要。利用胶体金与赭曲霉毒素Ａ单抗偶联物和赭曲霉毒素Ａ－ＢＳＡ偶联物（ＯＴＡ－ＢＳＡ），开发了一种快速检测赭曲霉毒素Ａ的方法。研究结果表明：１当ＯＴＡ－ＢＳＡ配制终质量浓度为４．８ ｇ·Ｌ～（－１），质控线用羊抗鼠Ｉｇｇ配制终质量浓度为１．５ ｇ·Ｌ～（－１），硝酸纤维素（ＮＣ）膜的包被量为１．０μＬ·Ｃｍ～（－１）时呈现最清晰、最均匀的条带。２赭曲霉毒素Ａ胶体金快速检测试纸条的灵敏度达到１．０μｇ·Ｌ～（－１），检测时间仅为５ ｍＩＮ，非常适合现场快速检测。该检测试纸条具有携带方便、灵敏度高、特异性强等优点。由于本方法检测时间短，灵敏度高，与．．．
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