为明确几丁质酶在鸭梨抗病过程中的作用,以鸭梨为试材,提取总RNA,采用RT-PCR方法克隆几丁质酶基因PbChiⅡ,分析PbChiⅡ在梨黑星病菌诱导下的表达模式,构建原核表达载体pET30a-PbChiⅡ,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达PbChiⅡ蛋白,分析重组蛋白在非生物胁迫下的生长能力。结果表明:PbChiⅡ基因全长(基因登录号:KP876485)969bp,实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)分析显示,PbChiⅡ基因的表达受病原菌的调控,在

【目的】从鸭梨果实中克隆Pb Chi IV的全长c DNA序列,检测Pb Chi IV在根、茎、叶、果实以及在水杨酸(SA)和梨轮纹病菌诱导下的表达特性,以探讨该基因与SA信号转导及抗梨轮纹病菌的相关性。【方法】设计特异引物,克隆Pb Chi IV的全长序列,将测序得到的核苷酸序列和推导的氨基酸序列在NCBI上用BLAST进行序列相似性分析,利用Biot Edit软件对氨基酸序列进行比对,利用MEGA6.0构建系统发育树,利用实时荧光定量PCR技术分析该基因在梨不同组织以及在SA和梨轮纹病菌诱导下的表达。【结果】克隆了Pb Chi IV的c DNA序列为819 bp,Gen Bank数据库登录...

【目的】从鸭梨果实中克隆Ｐｂ Ｃｈｉ ｉＶ的全长Ｃ ＤＮＡ序列，检测Ｐｂ Ｃｈｉ ｉＶ在根、茎、叶、果实以及在水杨酸（ＳＡ）和梨轮纹病菌诱导下的表达特性，以探讨该基因与ＳＡ信号转导及抗梨轮纹病菌的相关性。【方法】设计特异引物，克隆Ｐｂ Ｃｈｉ ｉＶ的全长序列，将测序得到的核苷酸序列和推导的氨基酸序列在ＮＣｂｉ上用ｂＬＡＳＴ进行序列相似性分析，利用ｂｉｏＴ ＥＤｉＴ软件对氨基酸序列进行比对，利用ＭＥＧＡ６．０构建系统发育树，利用实时荧光定量ＰＣＲ技术分析该基因在梨不同组织以及在ＳＡ和梨轮纹病菌诱导下的表达。【结果】克隆了Ｐｂ Ｃｈｉ ｉＶ的Ｃ ＤＮＡ序列为８１９ ｂＰ，ＧＥＮ ｂＡＮｋ数据库登录．．．

【目的】从鸭梨中克隆GAPDH基因家族,筛选合适的鸭梨内参基因。【方法】采用同源克隆的方法,克隆鸭梨GAPDH基因家族,用半定量PCR方法分析4个鸭梨GAPDH基因在鸭梨幼叶、花蕾、盛花期花瓣、幼果期果肉和成熟期果心,以及幼果期、膨大期、成熟期和褐变期果心的表达特征。【结果】从鸭梨中成功克隆出了4个GAPDH基因,分别命名为PbGAPDHa、PbGAPDHb、PbGAPDHc1和PbGAPDHc2。其中PbGAPDHa和Pb-GAPDHb是由一个共同的祖先基因倍增进化来的,主要在鸭梨的幼叶中表达,其蛋白定位在质体;而PbGAPDHc1和PbGAPDHc2是一个基因的2种拷贝形式,在鸭梨的花、幼...

【目的】克隆鸭梨苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)序列,并分析其在果实发育阶段和机械伤害时的表达模式,为研究鸭梨褐变机制提供理论依据。【方法】采用同源克隆方法,获得鸭梨PAL全长序列;利用在线生物信息学软件对其进行分析;采用MEGA 5.1软件构建PAL蛋白系统进化树;利用实时荧光定量PCR技术分析PAL在鸭梨果实发育阶段及受机械伤害过程中的表达。【结果】在鸭梨中获得了2个含完整CDS区的PAL,分别命名为PbPAL1和PbPAL2。PbPAL1 cDNA序列全长为2 232 bp,含2 160 bp完整开放阅读框、60 bp的5′非翻译区及12 bp的3′非翻译区,GenBank登录号为GU906...

［目的］通过克隆‘砀山酥梨’（Ｐｙｒｕｓ ｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉ ‘ｄａｎｇｓｈａｎｓｕｌｉ’）果实中咖啡酰－辅酶ａＯ－甲基转移酶（ｃｃＯａＯＭｔ）基因的全长序列，并对其进行生物信息学及基因表达差异分析，阐释了其在梨果实木质素合成途径的作用，以期为今后利用基因调控技术来改变果实中石细胞含量从而改善梨果实品质提供一定的理论依据。［方法］以１５年生‘砀山酥梨’果实为试材，根据从ｎｃｂｉ数据库中搜索得到关于植物木质化的ｃｃＯａＯＭｔ基因序列与梨基因组数据库调取的序列比对，利用ｒｔ－Ｐｃｒ技术克隆得到了木质素生物合成途径中的一种关键酶基因ＰｂｃｃＯａＯＭｔ，ｇｅｎｂａｎｋ登录号为ｋＪ５７７５４４．．．

[目的]通过克隆‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri ‘Dangshansuli’)果实中咖啡酰-辅酶AO-甲基转移酶(CCoAOMT)基因的全长序列,并对其进行生物信息学及基因表达差异分析,阐释了其在梨果实木质素合成途径的作用,以期为今后利用基因调控技术来改变果实中石细胞含量从而改善梨果实品质提供一定的理论依据。[方法]以15年生‘砀山酥梨’果实为试材,根据从NCBI数据库中搜索得到关于植物木质化的CCoAOMT基因序列与梨基因组数据库调取的序列比对,利用RT-PCR技术克隆得到了木质素生物合成途径中的一种关键酶基因PbCCoAOMT,GenBank登录号为KJ577544...

摘要：通过克隆‘砀山酥梨’（Pyrusbretschneideri ‘Dangshansuli’）果实中咖啡酰-辅酶 AO-甲基转移酶（CCoAOMT）基因的全长序列，并对其进行生物信息学及基因表达差异分析，阐释了其在梨果实木质素合成途径的作用，以期为今后利用基因调控技术来改变果实中石细胞含量从而改善梨果实品质提供一定的理论依据。以 15 年生‘砀山酥梨’果实为试材，根据从 NCBI数据库中搜索得到关于植物木质化的 CCoAOMT基因序列与梨基因组数据库调取的序列比对，利用 RT-PCR 技术克隆得到了木质素生物合成途径中的一种关键酶基因 PbCCoAOMT，GenBank 登录号为 KJ57...

分别以轻度、中度和重度缺铁的‘砀山酥梨’叶片cDNA为模板,正常叶片为对照,运用RACE技术,克隆Fer2基因的cDNA全长为1 052 bp,编码区828 bp,编码276个氨基酸。采用Protparam、InterProScan和ProtFun 2.2 Server等生物学信息软件分析蛋白质理化性质和结构域特征,结果表明:Fer2与‘翠冠’梨叶片的Fer2蛋白和Fer4蛋白等具有较高的相似性,故命名该基因为PbFer2。推测蛋白质相对分子质量为3 054.3,理论等电点为5.80。通过Real-time PCR技术,分析PbFer2基因表达量,结果表明:轻度缺铁会提高PbFer2的表达量,...

为挖掘我国特有的果实香气浓郁的梨资源，弄清其果实芳香成分及含量，并进而研究它们在梨果实中的代谢与调节机制。采用气相色谱质谱联用（ＧＣ－ＭＳ）技术，分析了我国部分秋子梨品种果实的香气成分，在基础上，以挖掘出的‘南果梨’为试材，采用ＲＡＣＥ技术克隆了与其果实特异香气成分生物合成相关的α－法尼烯合成酶基因（ＰｕＦＳ），并采用半定量ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）技术分析了该基因在其果实不同发育时期和不同部位的时空表达规律。结果表明：‘荣香’、‘龙香’、‘香水’和‘晚香’的主要香气成分为醛类物质，‘南果’、‘大南果’和‘寒香’梨主要香气成分为酯类物质。在‘南果’梨中还检测出了高含量的α－法尼烯，而在其他品种中α．．．

[目的]本文旨在克隆‘黄冠梨’钾转运体PbKT8基因,对基因定位及表达特征进行初步分析,为其功能研究提供基础。[方法]从‘黄冠梨’果实中克隆PbKT8基因的cDNA全长序列,利用生物信息学对其同源序列进行分析,构建含GFP载体并通过激光共聚焦显微镜精确定位蛋白位置,实时荧光定量PCR分析不同施钾处理下该基因在果实成熟期的表达特征。[结果]钾转运体PbKT8基因序列全长2 328 bp,编码775个氨基酸,PbKT8蛋白与苹果(Malus domestica)进化关系最相近,同源序列相似性高达99.10%;亚细胞定位结果显示,PbKT8蛋白定位于细胞膜上;PbKT8基因转化酵母突变菌株R5421在低于5 mmol·L~(-1) K~+培养基上恢复生长;qRT-PCR结果表明,PbKT8基因在果实和叶片中相对表达量随施钾水平增加而上升。[结论]PbKT8蛋白定位在质膜上具有转运钾离子的功能,在果实成熟期受高钾响应表达。

中矮1号(Pyrus communis)是中国农业科学院果树研究所选育的梨优良矮化砧木,为研究其矮化机理,应用同源克隆的方法从中矮1号叶片总RNA中克隆赤霉素合成过程中的关键酶——内根-贝壳杉烯合酶(KS)基因的cDNA全长序列,并对该基因在不同梨品种中的表达进行分析。结果表明:基于苹果基因组序列设计的特异引物从中矮1号的总RNA中扩增出了1个编码框全长为2214 bp的cDNA序列,其编码737个氨基酸残基,推断分子量为83.63 kD,等电点为5.37。其氨基酸序列与报道的其他植物KS氨基酸序列的相似性为53.61%～72.63%,其中,与板栗(AEF32083.1)的相似性最高,其氨基酸...

【目的】比较窖藏和冷藏过程中,鸭梨果实品质、呼吸速率、乙烯释放速率、电子鼻特征、挥发性物质及其相关基因表达的差异,进一步解析两种贮藏方式对鸭梨香气物质形成的影响及其机制。【方法】鸭梨采收后以窖藏和冷藏两种方式贮藏,测定贮藏期间果实硬度、可溶性固形物含量(SSC)、可滴定酸(TA)含量、呼吸速率和乙烯释放速率,使用电子鼻检测挥发性物质变化,利用气质联用色谱(GC-MS)测定挥发性物质成分及含量,利用荧光定量PCR(Real-time PCR)技术分析乙烯生成(PbACS1、PbACO2)及其信号转导(PbETR1、PbETR2、PbERS1a、PbERS1b、PbEIN3、PbERF)、挥发性物质合成(PbAAT1、PbADH2、PbADH3、PbADH5、PbHPL、PbLOX1、PbLOX8)相关基因的表达量变化情况。【结果】冷藏期间,鸭梨果实硬度变化较小,SSC上升,TA含量下降。窖藏时,果实硬度下降比较明显,但对SSC的影响较小,而TA含量增加。与冷藏相比,窖藏下果实呼吸速率较高,乙烯释放高峰提前1个月出现,且其峰值较高。电子鼻可有效区分两种贮藏方式下的挥发性物质,其中W1W、W5S、W2W、W1S这4种传感器对挥发性物质区分起主要作用;窖藏期间果实挥发性物质较多。鸭梨果皮和果肉的挥发性物质包含醛类、酯类、醇类、萜类、烷烃类等,且果皮中含量较高;窖藏果皮和果肉、冷藏果皮和果肉中分别检出36种和33种、28种和24种挥发性物质,窖藏鸭梨较冷藏时生成更多的乙酯类化合物,其中己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、(E,Z)2,4-癸二烯酸乙酯等为果皮主要香味物质,己酸乙酯、丁酸乙酯为果肉主要香味物质。相关基因的表达分析表明,与冷藏相比,窖藏明显上调鸭梨果皮和果肉ACC氧化酶(PbACO2)、脂氧合酶(PbLOX1)和醇酰基转移酶(PbAAT1)相关基因的表达,下调乙烯不敏感转录因子(PbEIN3)的表达。【结论】在贮藏3个月内,与冷藏鸭梨相比,窖藏条件明显促进乙烯生成(PbACO2)和香气合成(PbLOX1、PbAAT1)等基因的表达,此时果实具有较多的香气物质种类和较高含量,表现出香味浓郁的特点。

为深入研究胡杨的抗盐分子机制,并获得与之相关的抗逆基因,采用SMART技术构建了胡杨盐胁迫处理cDNA文库。经随机测序,得到一个编号为SSL061的EST序列,与欧美杨的脱水素基因有较高相似性,通过PCR快速扩增文库的方法获得了胡杨脱水素基因(Pedhn)。分析表明,该cDNA的长度为813 bp,拥有681 bp的开放读码框,共编码227个氨基酸。该序列包括两个重复的富含赖氨酸的K片段和由7个连续的丝氨酸残基组成的S片段,但是缺乏Y片段。RT-PCR结果表明,胡杨在未受胁迫的情况下脱水素基因的转录水平较低,而随着盐胁迫浓度的升高,脱水素基因的转录水平总体呈上升趋势。

【目的】从鸭组织中克隆鸭β-防御素(AvBD)2基因,在大肠杆菌中高效表达,检测重组鸭AvBD2蛋白的生物学特性。【方法】应用RT-PCR技术从鸭胰腺组织中扩增鸭AvBD2基因,根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素-2的氨基酸序列构建系统进化树,将该基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上进行原核表达,对该重组蛋白进行纯化,测定体外抗菌活性与理化特性。【结果】鸭胰腺组织中克隆出鸭AvBD2基因的cDNA大小为195bp,编码64个氨基酸。同源性分析表明,鸭AvBD2与其它物种AvBD2同源性较高。凝胶电泳结果显示重组鸭AvBD2蛋白在原核高效表达(分子量约为32kD),...