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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王钰 王经满 曹瑞兵
[目的]2012年10月徐州地区某鸭场的樱桃谷种鸭突然发生产蛋下降,疑似鸭坦布苏病毒病。为了确诊病因,本试验进行了剖检与病原的分离鉴定。[方法]将病料匀浆处理后尿囊腔接种SPF鸡胚,分离病毒,接种BHK细胞培养,应用RT-PCR扩增病毒全基因,测序并进行基因进化分析。[结果]分离到一株鸭坦布苏病毒,命名为DTMUV XZ-2012株。该病毒株能适应鸡胚,无血凝活性,在BHK-21细胞上第5代的病毒滴度为5×104PFU·m L-1。测序结果表明该病毒株基因组全长为10 990 nt,编码的多聚蛋白含3 426个氨基酸。DTMUV XZ-2012株与BYD株、YY5株和JS_2010株等分离株的...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
潘金金 邹晓艳 李鑫 宿春虎 柴茂 姜逸 胡艳芬 赵国 王彦红 石火英 陈素娟 彭大新
【目的】分离鹅源坦布苏病毒,并研究其对雏鹅的致病性。【方法】用RT-PCR方法对江苏省3个鹅场送检的产蛋期病鹅样品进行检测;对坦布苏病毒核酸阳性的样品进行病毒分离,测定分离病毒的生物学特性和E蛋白基因序列。【结果】这些样品中坦布苏病毒呈阳性;从病料中分离鉴定一株病毒,命名为SHYG。E蛋白基因序列同源性比对显示其与中国鸭源坦布苏病毒同源性达到99.3%;生物学特性研究表明该病毒可致Vero细胞病变,对小鼠无致病性,接种2周龄雏鹅出现精神沉郁、腹泻、神经症状甚至死亡;组织学变化可见肝脏淤血、胆小管扩张、脂肪变性;肺淤血、炎性渗出及含铁血黄素沉着,脾脏网状内皮细胞空泡化,肾出血,脑充血、胶质细胞增...
关键词：
鹅 坦布苏病毒 致病性
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
庄育彬 王伟 许丽惠 刘梦茜 星东 蔡一龙 温亚萍 吴宝成 王全溪
采用分子克隆技术对鸭坦布苏病毒（ＤＴＭＵＶ）Ｅ蛋白基因进行克隆，同时运用多种生物学软件对该基因进行结构和生物学功能预测和分析．结果表明，本试验成功克隆了ＤＴＭＵＶ ＬＨ株Ｅ蛋白基因，该基因包含一个１ ５００ ｂｐ的开放阅读框，编码５００个氨基酸．遗传进化树分析表明，该蛋白与我国其他省份分离株的同源性很高．该蛋白的分子质量为５４．３ ｋＵ，等电点为７．６３，不存在信号肽序列，含有１７个糖基化位点，有１３个丝氨酸、４个络氨酸和８个苏氨酸的磷酸化位点．该蛋白存在跨膜区域，为亲水性蛋白．抗原位点分析表明，该蛋白有２１个抗原肽段．本试验结果为Ｅ蛋白的生物学功能和致病机理的研究奠定重要的分子理论基础．
关键词：
鸭坦布苏病毒 E蛋白 基因克隆 信号肽
[期刊] 中国农业科学
[作者]
于可响 马秀丽 袁小远 刘存霞 胡峰 凌红丽 李玉峰 黄兵
【目的】将鸭坦布苏病毒ＢＺ＿２０１０株在ＳＰＦ鸡胚上进行连续传代致弱；旨在选育安全性高、免疫原性好的活疫苗候选毒株。【方法】以ＳＰＦ鸡胚为增殖宿主，将ＢＺ＿２０１０株连续传代，直至第１２０代；以１日龄雏鸭和３０周龄的产蛋种鸭为试验对象，对第１２０代次毒株（命名为ＶＣ２）的安全性进行评价；以１ｄ雏鸭为试验对象，对ＶＣ２株的返强情况进行评价；以１８周龄的种鸭为试验对象，对ＶＣ２株免疫后的中和抗体进行监测；以２５周龄的种鸭为试验对象，对ＶＣ２株免疫后的保护效果进行评价；利用ＲＴ－ＰＣＲ方法分别扩增ＢＺ＿２０１０株和ＶＣ２株的Ｅ基因和Ｎ５４Ａ基因，进行测序分析。【结果】传代病毒对鸡胚的平均死亡时间逐渐．．．
关键词：
鸭坦布苏病毒 鸡胚 弱化 活疫苗
[期刊] 中国农业科学
[作者]
杨志远 段会娟 王小蕾 刘立新 赵际成 潘洁 刘月焕 林健
【目的】比较鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus, DTMUV)分离株的毒力、分析E蛋白基因序列、研究抗原差异性,为鸭坦布苏病防控提供依据。【方法】将DTMUV-HB(2011)、DTMUV-AH(2014)、DTMUV-GX1(2012)、DTMUV-GX2(2015) 4株病毒接种10日龄易感鸭胚进行增殖,并利用6日龄SPF鸡胚测定ELD_(50)。根据测定的病毒含量,将分离毒株稀释为100ELD_(50)/0.5m L,人工感染40只180日龄健康北京鸭,进行临床症状观察、病毒分离、大体剖检,分析分离毒株的毒力有无差异。提取8株DTMUV分离病毒株的RNA,通过RT-PCR扩增E基因,分析比较不同地区的DTMUV的E基因核苷酸和氨基酸序列相似性,构建进化树。利用实验室建立的鸭坦布苏病毒血凝抑制试验分别测定4株病毒阳性血清对4株病毒的HI效价。同时采用固定病毒稀释血清法,利用C6/36细胞测定4株病毒阳性血清对4株DTMUV的血清中和效价。通过交叉血凝抑制试验和血清交叉中和试验比较4株病毒的抗原差异性(R值)。【结果】(1)各毒株的病毒含量范围在10~(4.7)—10~(5.3) ELD_(50)/0.1m L。人工感染鸭试验,攻毒后3 d鸭采食量和产蛋量均显著下降,各组病毒分离阳性率均在85%以上,剖检病变主要表现为卵泡变形、出血。(2)分离株序列分析结果表明,核苷酸序列相似性为95.7%—100%,推导氨基酸序列相似性在98.2%以上。遗传进化分析表明共同构成了一个进化分支。(3)4株病毒及其阳性血清进行血凝抑制交叉试验,计算的抗原性差异R值在0.79—1.12之间;进行细胞中和交叉试验,计算的R值在0.79—1.20之间。【结论】分离的4株DTMUV在毒力、E蛋白基因和抗原性上未见显著差异。
关键词：
鸭坦布苏病毒 毒力 E基因 抗原性
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王小蕾 刘月焕 段会娟 刘立新 杨志远 赵际成 潘洁 刘瑞华 赵文奇 田方杰 吕金宝 林健
【目的】研究鸭坦布苏病毒是否具有血凝性,确定其凝集的红细胞种类和血凝反应条件。【方法】鸭坦布苏病毒以不同稀释度经脑内途径接种1—3日龄的BALB/c乳鼠,观察乳鼠发病情况;收集发病乳鼠鼠脑,参照文献记载的方法用蔗糖-丙酮提纯病毒液;以适当灭活剂灭活病毒,观察灭活后的病毒液性状,并以6日龄SPF鸡胚进行灭活检验;参照文献记载的方法初步测定病毒液与鸡、鸭、鹅、鸽、猪红细胞悬液的反应性;比较并确定鸭坦布苏病毒进行血凝反应的适宜红细胞悬液浓度;比较pH6.0—7.0的反应体系对病毒血凝效价的影响;比较4℃、室温和37℃对病毒血凝反应结果的影响。【结果】乳鼠接种鸭坦布苏病毒后6日,1﹕10稀释接种组的乳鼠出现严重的临床症状,表现为四肢抽搐,瘫痪等。大部分乳鼠处于濒死状态,1﹕50和1﹕100稀释接种组的乳鼠症状稍轻于1﹕10稀释接种组乳鼠的症状;提纯后鸭坦布苏病毒液呈淡红色澄明液体,用甲醛灭活后病毒液性状无明显改变,但用β-丙内酯后产生大量絮状沉淀,性状发生明显改变;病毒液可以凝集鸡、鸭、鹅、鸽、猪红细胞悬液;不同浓度红细胞悬液的比较结果显示,病毒液与0.33%的红细胞悬液作用时凝集图形清晰稳定;通过不同pH反应体系的比较,发现病毒液在pH 6.0—6.8时均可发生血凝反应,当pH为6.0—6.2时凝集效价最高;通过不同反应温度的比较,证实病毒液在4℃、室温和37℃时均具有血凝性,但4℃时的血凝反应时间明显延长。【结论】乳鼠增殖的鸭坦布苏病毒提纯后具有广谱的血凝性,可以凝集鸡、鸭、鹅、鸽和猪的红细胞,血凝性稳定,在4℃、室温和37℃下均可以与鹅红细胞凝集,以0.33%浓度的红细胞悬液血凝为宜,反应最适pH为6.0—6.2。
关键词：
鸭坦布苏病毒 血凝 反应条件
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
吴美洲 陈芳洲 李中华 万胜锋 叶十一 何启盖
为研究猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ）变异株特性，通过细胞培养、细胞病变（ＣＰＥ）观察、ＲＴ－ＰＣＲ、间接免疫荧光实验和透射电镜观察分离鉴定１株ＰＥＤＶ变异株（ＣＨ／ＹＮＫＭ－８／２０１３株）并分析了全基因组序列。运用基因组分段扩增方法，测得该毒株的全基因组序列（ＧＥＮＢａＮＫ登录号为ＫＦ７６１６７５．１）。该毒株Ｓ基因Ｎ端比ＣＶ７７７毒株Ｓ基因的Ｎ端长９ＢＰ，包括１５ＢＰ的插入和６ＢＰ的缺失，表明ＣＨ／ＹＮＫＭ－８／２０１３为变异毒株。同源性分析显示，该毒株的基因组序列与我国广东２０１１年分离毒株ＬＣ的同源关系最近，相似性为９９．６％，与韩国毒株ＫＮＵ－１３０５和美国毒株ＵＳａ／ＭｉＮＮＥＳｏＴ．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
郭容利 倪艳秀 温立斌 李彬 王小敏 俞正玉 何孔旺
应用ST细胞,从临床上表现为腹泻症状的病死仔猪肠内容物中分离得到一株病毒,并对该病毒进行RTPCR,直接免疫荧光与动物回归等试验,证实该病毒为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV),命名为JS2012株。应用PCR方法克隆出其初代(P1TS)与50代(P50TS)的S基因片段,进行序列测定,并将该基因序列与已发表的18个不同来源的TGEV毒株进行同源性和亲缘关系的比较分析。结果表明,各毒株间核苷酸同源性为96.0%～99.9%,氨基酸的同源性为96.5%～99.9%。TGEVJS201PITS株与中国江苏省HN2002株和美国Miller M6亲缘较近,表明不同地区分离毒株的S基因差异不大,而与P1T...
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨金兴 朱瑞良
2011年从山东不同地区的发病鸡体内分离到4株新城疫病毒,分别命名为SD1～SD4。4株毒株经病毒蚀斑克隆纯化后动物回归试验可产生典型的NDV病变;为了解其遗传起源和分子特性对其融合蛋白(Fusion,F)进行序列和分子特性的分析。研究结果发现,生物学毒力测定显示4株毒株均为强毒。F蛋白多肽裂解位点的序列为112RRQKRF117,符合NDV强毒氨基酸基序。F基因分型显示,SD01、SD02、SD03和SD04与另外一株鸡源SG01以及广东鹅分离株等属于基因Ⅶ型。同源性比较显示:SD1-SD4与同期分离株的同源性明显高于其他的传统毒株,且与国内分离株的同源性高于国外的分离株。
关键词：
新城疫病毒 F基因 分子特性
[期刊] 华北农学报
[作者]
王小敏 何孔旺 周忠涛 茅爱华 俞正玉 汪伟 倪艳秀 温立斌 张雪寒 郭容利 李彬 于洋
从江苏某猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪场采集的血清样本中分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株,对该毒株的生物学特性进行了鉴定,并对其Nsp2和ORF5序列进行测定和序列比对分析。利用细胞传代的方法对PRRSV检测阳性,PPV和PRV检测阴性的猪血清进行病毒分离。通过RT-PCR、CPE和IFA对PRRSV分离毒株进行鉴定,并测定其TCID50。测序获得Nsp2和ORF5基因,并利用DNAStar软件进行序列同源性和进化分析。成功分离获得1株PRRSV毒株,该毒株能够在Marc-145细胞上增殖并产生细胞病变,免疫荧光检测可观察到特异性荧光,TCID50为105.5。Nsp2...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
汤智慧 郭抗抗 张彦明 王津津 李宇立 向华
【目的】分离得到猪圆环病毒2型(PCV-2)陕西杨凌株,测定病毒滴度(TCID50),并进行全基因组序列比对,为研制针对性更强的PCV-2疫苗提供理论依据。【方法】从经PCR检测为猪圆环病毒2型阳性的病料中,分离病毒并接种PK-15细胞,通过PCR检测、间接免疫荧光试验及电镜观察,对分离病毒进行鉴定;用免疫过氧化物酶细胞单层试验(IPMA),测定分离毒株的TCID50,并对其全基因组序列进行测定与分析。【结果】分离得到1株猪圆环病毒2型毒株,分离株在PK-15细胞上的TCID50为10-4.75。全基因组序列同源性比对发现,分离株与一加拿大分离株(DQ200735)同源性最高(99.4%)。【...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
曾显成 吴异健 陈家祥 姚金水 吴宝成
采集福州郊区病仔猪的鼻腔黏液、脑、脾脏、肾脏、淋巴结等组织病料,研磨上清接种到非洲绿猴肾(Vero)细胞和狗肾(MDCK)细胞进行病毒分离,通过对分离病毒株进行形态学、血清学、荧光抗体试验、动物接种试验、PCR试验等鉴定,确定所分离的病毒为猪伪狂犬病病毒(PRV),命名为PRV-FZ株.根据GenBank收录的PRV gD基因的序列设计一对引物,通过PCR方法扩增出约1579 bp的目的片段,并将其克隆到PCAGGS载体进行酶切鉴定、核苷酸序列测定和分析.结果表明,目的片段包含一个1203 bp的开放阅读框,编码400个氨基酸组成的多肽,与GenBank中有代表性的5株参考毒株相应基因序列比较...
[期刊] 华北农学报
[作者]
韩凯凯 严若峰 刘青涛 刘宇卓 李银 赵冬敏 黄欣梅 章丽娇 杨婧 付晨
旨在对鸭坦布苏病毒NS5蛋白功能基团RNA依赖RNA聚合酶进行真核表达,同时对其蛋白结构和功能进行生物信息学分析。首先查找GenBank数据库中收录的DTMUV基因序列,以RdRp基因为研究对象,通过软件设计并合成特异性引物,RT-PCR技术扩增RdRp基因,回收PCR产物并与pCMV-N-Flag真核表达载体相连接,构建真核表达质粒pCMV-Flag-RdRp,将测序无误的质粒转染至BHK-21细胞,通过Western Blot和间接免疫荧光技术检测该蛋白在BHK-21细胞内的表达。同时针对RdRp蛋白,利用生物信息学软件进行序列分析、结构解析及功能预测。通过PCR方法成功扩增RdRp基因,构建的真核表达质粒pCMV-Flag-RdRp经双酶切鉴定证明正确,进一步通过间接免疫荧光技术与Western Blot检测发现,重组质粒pCMV-Flag-RdRp在BHK-21细胞内正常表达,生物信息学分析发现,RdRp蛋白编码606个氨基酸,分子式为C_(3091)H_(4810)N_(870)O_(894)S_(41),编码蛋白亲水性平均系数为-0.536,不稳定指数为42.15,含有丰富的磷酸化位点及O-糖基化位点。其二级结构包含46.37%的α-螺旋、12.54%的延伸链以及35.31%的无规则卷曲。上述结果为进一步研究坦布苏病毒致病性打下了基础。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
李坤 吴家强 张金强 李俊 于江 刘洋 张玉玉 刘少宁 王兆 周顺 王金宝
从山东某大型猪场患"猪高热病"的病料中分离到1株病毒,该病毒可在Marc-145细胞上增殖,产生细胞病变。经RT-PCR鉴定证明,该病毒为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),将其命名为WF-1株。用RT-PCR法分别扩增该分离株的NSP2基因和ORF5基因,并进行核苷酸序列测定和分析。结果表明,PRRSV WF-1株的NSP2发生30个氨基酸的不连续缺失,缺失位置与PRRSV参考变异株JXA1相同;ORF5基因与JXA1、CH-1a、VR2332核苷酸同源性分别为98.0%、94.2%、86.4%,氨基酸同源性分别为97.5%、94.0%、87.5%。基因遗传进化树分析结果显示,WF-...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
韩春华 赵际成 段会娟 林健 杨志远 谢佳 潘洁 王小蕾 刘立新 刘月焕
【目的】评价鸭坦布苏病毒病灭活疫苗母源抗体的效力，制定疫苗的最小免疫日龄。【方法】随机采集鸭坦布苏病毒病灭活疫苗（ＨＢ株）二免后１３５日樱桃谷种鸭的种蛋孵化，随机取５、７、１０和１５日龄免疫种鸭后裔雏鸭１０只和相对应日龄非免疫种鸭后裔雏鸭５只，采血，分离血清，测定母源抗体，并以０．１ｍ Ｌ／羽（含１００ＤＩＤ＿（５０））的剂量经腿部肌肉攻毒。观察雏鸭攻毒后的临床表现（采食量、粪便、精神和死亡情况），观察至攻毒后１０Ｄ。攻毒后２Ｄ经颈静脉采血，分离血清进行病毒分离。每份血清接种５枚６日龄ＳＰＦ鸡胚，０．１ｍ Ｌ／枚，３７℃孵化，２４Ｈ以内死亡鸡胚视为非特异死亡，孵化至１６８Ｈ。只要有１枚及以上鸡．．．
关键词：
鸭 坦布苏病毒 母源抗体
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