【目的】将鸭坦布苏病毒ＢＺ＿２０１０株在ＳＰＦ鸡胚上进行连续传代致弱；旨在选育安全性高、免疫原性好的活疫苗候选毒株。【方法】以ＳＰＦ鸡胚为增殖宿主，将ＢＺ＿２０１０株连续传代，直至第１２０代；以１日龄雏鸭和３０周龄的产蛋种鸭为试验对象，对第１２０代次毒株（命名为ＶＣ２）的安全性进行评价；以１ｄ雏鸭为试验对象，对ＶＣ２株的返强情况进行评价；以１８周龄的种鸭为试验对象，对ＶＣ２株免疫后的中和抗体进行监测；以２５周龄的种鸭为试验对象，对ＶＣ２株免疫后的保护效果进行评价；利用ＲＴ－ＰＣＲ方法分别扩增ＢＺ＿２０１０株和ＶＣ２株的Ｅ基因和Ｎ５４Ａ基因，进行测序分析。【结果】传代病毒对鸡胚的平均死亡时间逐渐．．．

[目的]2012年10月徐州地区某鸭场的樱桃谷种鸭突然发生产蛋下降,疑似鸭坦布苏病毒病。为了确诊病因,本试验进行了剖检与病原的分离鉴定。[方法]将病料匀浆处理后尿囊腔接种SPF鸡胚,分离病毒,接种BHK细胞培养,应用RT-PCR扩增病毒全基因,测序并进行基因进化分析。[结果]分离到一株鸭坦布苏病毒,命名为DTMUV XZ-2012株。该病毒株能适应鸡胚,无血凝活性,在BHK-21细胞上第5代的病毒滴度为5×104PFU·m L-1。测序结果表明该病毒株基因组全长为10 990 nt,编码的多聚蛋白含3 426个氨基酸。DTMUV XZ-2012株与BYD株、YY5株和JS_2010株等分离株的...

【目的】研究鸭坦布苏病毒是否具有血凝性,确定其凝集的红细胞种类和血凝反应条件。【方法】鸭坦布苏病毒以不同稀释度经脑内途径接种1—3日龄的BALB/c乳鼠,观察乳鼠发病情况;收集发病乳鼠鼠脑,参照文献记载的方法用蔗糖-丙酮提纯病毒液;以适当灭活剂灭活病毒,观察灭活后的病毒液性状,并以6日龄SPF鸡胚进行灭活检验;参照文献记载的方法初步测定病毒液与鸡、鸭、鹅、鸽、猪红细胞悬液的反应性;比较并确定鸭坦布苏病毒进行血凝反应的适宜红细胞悬液浓度;比较pH6.0—7.0的反应体系对病毒血凝效价的影响;比较4℃、室温和37℃对病毒血凝反应结果的影响。【结果】乳鼠接种鸭坦布苏病毒后6日,1﹕10稀释接种组的乳鼠出现严重的临床症状,表现为四肢抽搐,瘫痪等。大部分乳鼠处于濒死状态,1﹕50和1﹕100稀释接种组的乳鼠症状稍轻于1﹕10稀释接种组乳鼠的症状;提纯后鸭坦布苏病毒液呈淡红色澄明液体,用甲醛灭活后病毒液性状无明显改变,但用β-丙内酯后产生大量絮状沉淀,性状发生明显改变;病毒液可以凝集鸡、鸭、鹅、鸽、猪红细胞悬液;不同浓度红细胞悬液的比较结果显示,病毒液与0.33%的红细胞悬液作用时凝集图形清晰稳定;通过不同pH反应体系的比较,发现病毒液在pH 6.0—6.8时均可发生血凝反应,当pH为6.0—6.2时凝集效价最高;通过不同反应温度的比较,证实病毒液在4℃、室温和37℃时均具有血凝性,但4℃时的血凝反应时间明显延长。【结论】乳鼠增殖的鸭坦布苏病毒提纯后具有广谱的血凝性,可以凝集鸡、鸭、鹅、鸽和猪的红细胞,血凝性稳定,在4℃、室温和37℃下均可以与鹅红细胞凝集,以0.33%浓度的红细胞悬液血凝为宜,反应最适pH为6.0—6.2。

采用分子克隆技术对鸭坦布苏病毒（ＤＴＭＵＶ）Ｅ蛋白基因进行克隆，同时运用多种生物学软件对该基因进行结构和生物学功能预测和分析．结果表明，本试验成功克隆了ＤＴＭＵＶ ＬＨ株Ｅ蛋白基因，该基因包含一个１ ５００ ｂｐ的开放阅读框，编码５００个氨基酸．遗传进化树分析表明，该蛋白与我国其他省份分离株的同源性很高．该蛋白的分子质量为５４．３ ｋＵ，等电点为７．６３，不存在信号肽序列，含有１７个糖基化位点，有１３个丝氨酸、４个络氨酸和８个苏氨酸的磷酸化位点．该蛋白存在跨膜区域，为亲水性蛋白．抗原位点分析表明，该蛋白有２１个抗原肽段．本试验结果为Ｅ蛋白的生物学功能和致病机理的研究奠定重要的分子理论基础．

【目的】比较鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus, DTMUV)分离株的毒力、分析E蛋白基因序列、研究抗原差异性,为鸭坦布苏病防控提供依据。【方法】将DTMUV-HB(2011)、DTMUV-AH(2014)、DTMUV-GX1(2012)、DTMUV-GX2(2015) 4株病毒接种10日龄易感鸭胚进行增殖,并利用6日龄SPF鸡胚测定ELD_(50)。根据测定的病毒含量,将分离毒株稀释为100ELD_(50)/0.5m L,人工感染40只180日龄健康北京鸭,进行临床症状观察、病毒分离、大体剖检,分析分离毒株的毒力有无差异。提取8株DTMUV分离病毒株的RNA,通过RT-PCR扩增E基因,分析比较不同地区的DTMUV的E基因核苷酸和氨基酸序列相似性,构建进化树。利用实验室建立的鸭坦布苏病毒血凝抑制试验分别测定4株病毒阳性血清对4株病毒的HI效价。同时采用固定病毒稀释血清法,利用C6/36细胞测定4株病毒阳性血清对4株DTMUV的血清中和效价。通过交叉血凝抑制试验和血清交叉中和试验比较4株病毒的抗原差异性(R值)。【结果】(1)各毒株的病毒含量范围在10~(4.7)—10~(5.3) ELD_(50)/0.1m L。人工感染鸭试验,攻毒后3 d鸭采食量和产蛋量均显著下降,各组病毒分离阳性率均在85%以上,剖检病变主要表现为卵泡变形、出血。(2)分离株序列分析结果表明,核苷酸序列相似性为95.7%—100%,推导氨基酸序列相似性在98.2%以上。遗传进化分析表明共同构成了一个进化分支。(3)4株病毒及其阳性血清进行血凝抑制交叉试验,计算的抗原性差异R值在0.79—1.12之间;进行细胞中和交叉试验,计算的R值在0.79—1.20之间。【结论】分离的4株DTMUV在毒力、E蛋白基因和抗原性上未见显著差异。

【目的】了解产蛋鸭感染鸭坦布苏病毒后卵巢病变产生的进程和卵巢病变规律，为采用产蛋鸭卵巢病理变化检查法进行疫苗效力检验提供依据。【方法】７０只２６０日龄产蛋樱桃谷鸭，以０．５ｍ Ｌ／只（含１００ＤＩＤ５０）的剂量经胸部肌肉接种鸭坦布苏病毒（ＨＢ株）强毒。观察试验鸭的临床症状，统计每日产蛋数和采食量。攻毒后２ Ｄ，每只鸭经翅静脉采血，分离血清，经卵黄囊途径接种５枚６日龄ＳＰＦ鸡胚，每胚０．１ｍ Ｌ。接种后置３７℃条件下继续孵化，２４ Ｈ死亡鸡胚弃去。采用ＲＴ－ＰＣＲ方法测定２４—７２ Ｈ死亡鸡胚的ＤＴｍＵＶ核酸，将１／５或以上鸡胚死亡且ＤＴｍＵＶ核酸阳性的鸭判为ＤＴｍＵＶ感染鸭。攻毒后４—１０ Ｄ．．．

【目的】评价鸭坦布苏病毒病灭活疫苗母源抗体的效力，制定疫苗的最小免疫日龄。【方法】随机采集鸭坦布苏病毒病灭活疫苗（ＨＢ株）二免后１３５日樱桃谷种鸭的种蛋孵化，随机取５、７、１０和１５日龄免疫种鸭后裔雏鸭１０只和相对应日龄非免疫种鸭后裔雏鸭５只，采血，分离血清，测定母源抗体，并以０．１ｍ Ｌ／羽（含１００ＤＩＤ＿（５０））的剂量经腿部肌肉攻毒。观察雏鸭攻毒后的临床表现（采食量、粪便、精神和死亡情况），观察至攻毒后１０Ｄ。攻毒后２Ｄ经颈静脉采血，分离血清进行病毒分离。每份血清接种５枚６日龄ＳＰＦ鸡胚，０．１ｍ Ｌ／枚，３７℃孵化，２４Ｈ以内死亡鸡胚视为非特异死亡，孵化至１６８Ｈ。只要有１枚及以上鸡．．．

【目的】分离鹅源坦布苏病毒,并研究其对雏鹅的致病性。【方法】用RT-PCR方法对江苏省3个鹅场送检的产蛋期病鹅样品进行检测;对坦布苏病毒核酸阳性的样品进行病毒分离,测定分离病毒的生物学特性和E蛋白基因序列。【结果】这些样品中坦布苏病毒呈阳性;从病料中分离鉴定一株病毒,命名为SHYG。E蛋白基因序列同源性比对显示其与中国鸭源坦布苏病毒同源性达到99.3%;生物学特性研究表明该病毒可致Vero细胞病变,对小鼠无致病性,接种2周龄雏鹅出现精神沉郁、腹泻、神经症状甚至死亡;组织学变化可见肝脏淤血、胆小管扩张、脂肪变性;肺淤血、炎性渗出及含铁血黄素沉着,脾脏网状内皮细胞空泡化,肾出血,脑充血、胶质细胞增...

【目的】评价鸭坦布苏病毒病灭活疫苗2种效力评价方法平行关系,为采用血清学检验技术替代鸭坦布苏病毒病灭活疫苗本动物攻毒效力检验奠定基础。【方法】3批疫苗实验室制品分别以0.15、0.3、0.5、1.0 mL经肌肉注射途径免疫51日龄青年鸭和260日龄产蛋鸭,首次免疫后14 d,按相同的剂量和途径进行二次免疫。二免后28日采血,分离血清并测定血清的HI抗体效价,根据抗体效价对试验鸭分组,并分别经肌肉注射途径接种0.5 mL(100 DID_(50))的鸭坦布苏病毒。攻毒后2 d采血,分离病毒,产蛋鸭攻毒后8 d剖检,观察卵巢病变。比较和分析HI抗体效价和攻毒保护结果的相关性。【结果】免疫青年鸭HI抗体效价≤1﹕5、1﹕10、1﹕20、1﹕40、1﹕80、1﹕160、1﹕320、1﹕640组保护率分别为50%(20/40)、43.8%(7/16)、74.3%(26/35)、86.7%(26/30)、96.6%(57/59)、92.7%(51/55)、95%(38/40)和100%(11/11),HI抗体效价低于1﹕20时攻毒保护率为48.2%,效价1﹕20时攻毒保护率为74.3%,效价1﹕40及以上时攻毒保护率达93.8%。免疫产蛋鸭HI抗体效价≤1﹕5、1﹕20、1﹕40和1﹕80组保护率分别为66.7%(12/18)、83.3%(10/12)、95.2%(20/21)和100%(15/15);HI抗体效价1﹕10、1﹕160、1﹕320和1﹕640组保护比例分别为2/3、7/7、1/1和2/2;HI抗体效价为1﹕10及以下时攻毒保护率为66.7%,效价1﹕20时攻毒保护率为83.3%,效价1﹕40及以上时攻毒保护率达97.8%。青年鸭和产蛋鸭的HI抗体效价与攻毒保护率之间均有极显著的正相关性,Spearman相关系数分别为0.905(P<0.01)和0.932(P<0.01)。【结论】鸭坦布苏病毒病灭活疫苗(HB株)免疫后HI抗体与攻毒保护率存在正相关,可替代免疫攻毒法用于鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的效力评价,初步将HI抗体效价1﹕20定为鸭坦布苏病毒病灭活疫苗免疫后产生抗体保护的标准。

旨在对鸭坦布苏病毒NS5蛋白功能基团RNA依赖RNA聚合酶进行真核表达,同时对其蛋白结构和功能进行生物信息学分析。首先查找GenBank数据库中收录的DTMUV基因序列,以RdRp基因为研究对象,通过软件设计并合成特异性引物,RT-PCR技术扩增RdRp基因,回收PCR产物并与pCMV-N-Flag真核表达载体相连接,构建真核表达质粒pCMV-Flag-RdRp,将测序无误的质粒转染至BHK-21细胞,通过Western Blot和间接免疫荧光技术检测该蛋白在BHK-21细胞内的表达。同时针对RdRp蛋白,利用生物信息学软件进行序列分析、结构解析及功能预测。通过PCR方法成功扩增RdRp基因,构建的真核表达质粒pCMV-Flag-RdRp经双酶切鉴定证明正确,进一步通过间接免疫荧光技术与Western Blot检测发现,重组质粒pCMV-Flag-RdRp在BHK-21细胞内正常表达,生物信息学分析发现,RdRp蛋白编码606个氨基酸,分子式为C_(3091)H_(4810)N_(870)O_(894)S_(41),编码蛋白亲水性平均系数为-0.536,不稳定指数为42.15,含有丰富的磷酸化位点及O-糖基化位点。其二级结构包含46.37%的α-螺旋、12.54%的延伸链以及35.31%的无规则卷曲。上述结果为进一步研究坦布苏病毒致病性打下了基础。

【目的】制备抗鸭坦布苏病毒（Ｄｕｃｋ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ，ＤＴｍｕｖ）Ｎｓ５蛋白的单克隆抗体。【方法】将实验室保存的ＰｅＴ２８ａ－Ｎｓ５载体转化入ｒｏｓｅＴＴａ（Ｄｅ３）感受态细胞中进行诱导表达，利用纯化的鸭坦布苏病毒Ｎｓ５蛋白作为抗原免疫ｂａＬｂ／ｃ小鼠，应用淋巴瘤细胞杂交技术结合有限稀释法制备单抗，并对单抗的特异性、反应性及其抗原表位和亚类进行鉴定。【结果】筛选获得２株稳定分泌针对ＤＴｍｕｖ的Ｎｓ５蛋白单抗的杂交瘤细胞，分别命名为ａ４Ｄ１和ｂ４ｂ８。此２株杂交瘤细胞诱导ｂａＬｂ／ｃ小鼠的抗体效价均可达到１∶６４ ０００。间接ｅＬｉｓａ、ＷｅｓＴｅｒＮ ｂＬｏＴ和间接免疫荧光（ｉＦａ．．．

【目的】前人研究表明禽呼肠孤病毒可以经卵垂直传播，禽呼肠孤病毒能引起雏禽的病毒性关节炎、呼吸道和肠道疾病、肝炎、心肌炎、免疫抑制等。以实验室分离的鸭呼肠孤病毒ＨＰ０８０４２１株为研究对象，该毒株引起病变主要以鸭软脚为主要临床特征，病鸭肝脏和脾脏表面有大量的白色坏死灶、肾脏肿大、出血为主要病变特点。鸭呼肠孤病毒对鸡胚的致病性研究，旨在通过雏鸡的病理变化特点，探讨所分离的ＨＰ０８０４２１鸭呼肠孤病毒株是否也可感染鸡群，为鸡场鸭呼肠孤病毒感染的防控提供理论依据。【方法】运用华中农业大学兽医病理学实验室分离鉴定的ＨＰ０８０４２１株鸭呼肠孤病毒通过尿囊腔接种ＳＰＦ鸡胚，建立ＳＰＦ鸡胚鸭呼肠孤病毒感染模型．．．

【目的】利用SYBR GreenⅠ荧光定量技术建立一种相对定量检测坦布苏病毒的方法。【方法】针对坦布苏病毒NS5、E基因分别设计了1对特异性引物,同时设计1对扩增内参基因β-actin引物,将PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,倍比稀释作为质控样品,用于实时荧光定量PCR中NS5、E基因及内参基因β-actin标准曲线的构建,并进行反应的灵敏性、特异性和重复性试验。【结果】结果显示标准曲线线性关系R2值均在0.99以上,检测极限约为1.0E+01拷贝数质粒DNA;特异性结果表明只能检测到坦布苏病毒的扩增曲线;批内和批间重复性试验的变异系数均小于0.5...

【目的】建立禽坦布苏病毒（ＡｖｉＡｎ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ，ＡＴｍｖ）ＴＡｑｍＡｎ实时荧光定量ＰＣｒ检测方法。【方法】根据ＡＴｍｖ非结构蛋白ｎｓ１的基因特征，设计特异性的引物和探针，建立基于ＴＡｑｍＡｎ探针检测ＡＴｍｖ的实时荧光定量ＰＣｒ检测方法，对其特异性、重复性进行检测。用建立的ＴＡｑｍＡｎ实时荧光定量ＰＣｒ检测方法和之前建立的ｒＴ－ＰＣｒ方法同时对临床１５份疑似ＡＴｍｖ感染的病料进行检测，计算其符合率。【结果】成功建立了检测ＡＴｍｖ的实时荧光定量ＰＣｒ检测方法，当ｎｓ１基因含量为（２．６７×１０２）～（２．６７×１０７）拷贝／μＬ时有良好的线性扩增，其扩增相关系数为０．９９８，扩增．．．

根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS1基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR方法扩增得到完整的NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pET28a和pET32a上,构建出重组表达质粒pET28a-NS1和pET32a-NS1,转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导得到NS1融合蛋白(His-NS1),其分子质量约分别为44,58 kDa,均在诱导后6 h达到表达量高峰。分析显示,2种融合蛋白均以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性后均可获得单一、高表达量的目的蛋白,为进一步开展关于鹅坦布苏病毒NS1蛋白的研究奠定了基础。