【目的】评价鸭坦布苏病毒病灭活疫苗母源抗体的效力，制定疫苗的最小免疫日龄。【方法】随机采集鸭坦布苏病毒病灭活疫苗（ＨＢ株）二免后１３５日樱桃谷种鸭的种蛋孵化，随机取５、７、１０和１５日龄免疫种鸭后裔雏鸭１０只和相对应日龄非免疫种鸭后裔雏鸭５只，采血，分离血清，测定母源抗体，并以０．１ｍ Ｌ／羽（含１００ＤＩＤ＿（５０））的剂量经腿部肌肉攻毒。观察雏鸭攻毒后的临床表现（采食量、粪便、精神和死亡情况），观察至攻毒后１０Ｄ。攻毒后２Ｄ经颈静脉采血，分离血清进行病毒分离。每份血清接种５枚６日龄ＳＰＦ鸡胚，０．１ｍ Ｌ／枚，３７℃孵化，２４Ｈ以内死亡鸡胚视为非特异死亡，孵化至１６８Ｈ。只要有１枚及以上鸡．．．

【目的】评价鸭坦布苏病毒病灭活疫苗2种效力评价方法平行关系,为采用血清学检验技术替代鸭坦布苏病毒病灭活疫苗本动物攻毒效力检验奠定基础。【方法】3批疫苗实验室制品分别以0.15、0.3、0.5、1.0 mL经肌肉注射途径免疫51日龄青年鸭和260日龄产蛋鸭,首次免疫后14 d,按相同的剂量和途径进行二次免疫。二免后28日采血,分离血清并测定血清的HI抗体效价,根据抗体效价对试验鸭分组,并分别经肌肉注射途径接种0.5 mL(100 DID_(50))的鸭坦布苏病毒。攻毒后2 d采血,分离病毒,产蛋鸭攻毒后8 d剖检,观察卵巢病变。比较和分析HI抗体效价和攻毒保护结果的相关性。【结果】免疫青年鸭HI抗体效价≤1﹕5、1﹕10、1﹕20、1﹕40、1﹕80、1﹕160、1﹕320、1﹕640组保护率分别为50%(20/40)、43.8%(7/16)、74.3%(26/35)、86.7%(26/30)、96.6%(57/59)、92.7%(51/55)、95%(38/40)和100%(11/11),HI抗体效价低于1﹕20时攻毒保护率为48.2%,效价1﹕20时攻毒保护率为74.3%,效价1﹕40及以上时攻毒保护率达93.8%。免疫产蛋鸭HI抗体效价≤1﹕5、1﹕20、1﹕40和1﹕80组保护率分别为66.7%(12/18)、83.3%(10/12)、95.2%(20/21)和100%(15/15);HI抗体效价1﹕10、1﹕160、1﹕320和1﹕640组保护比例分别为2/3、7/7、1/1和2/2;HI抗体效价为1﹕10及以下时攻毒保护率为66.7%,效价1﹕20时攻毒保护率为83.3%,效价1﹕40及以上时攻毒保护率达97.8%。青年鸭和产蛋鸭的HI抗体效价与攻毒保护率之间均有极显著的正相关性,Spearman相关系数分别为0.905(P<0.01)和0.932(P<0.01)。【结论】鸭坦布苏病毒病灭活疫苗(HB株)免疫后HI抗体与攻毒保护率存在正相关,可替代免疫攻毒法用于鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的效力评价,初步将HI抗体效价1﹕20定为鸭坦布苏病毒病灭活疫苗免疫后产生抗体保护的标准。

为了探明大鲵虹彩病毒病灭活疫苗的安全性与免疫效力,采用β-丙内酯(β-propiolactone, BPL)灭活鲤上皮瘤细胞(Epithelioma papilloma cyprini,EPC)内增殖的大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovirus, GSIV),制备成大鲵虹彩病毒病灭活疫苗,利用免疫剂量为1.0×10~6 TCID_(50)/mL的灭活疫苗腹腔注射健康大鲵(Andrias davidianus),研究疫苗的安全性和免疫效力。结果显示:一次单剂量注射、单剂量重复注射和超剂量注射后,大鲵的行为和摄食均正常,未见不良反应,证明了制备的大鲵虹彩病毒病灭活疫苗安全;用不同剂量的疫苗(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL/尾)免疫健康大鲵,在免疫后第28 d用GSIV进行攻毒,当免疫剂量为0.1 mL/尾时,相对免疫保护率为44.44%,其它4种免疫剂量的相对免疫保护率相似,均高于70%。大鲵在免疫后7 d已开始产生免疫应答,21 d血清抗体效价达到最高值252.48±28.01。在免疫后两周内,MyD88基因、TLR9基因和MHCIIA基因均显著上调。免疫后150 d进行攻毒实验,大鲵的相对免疫保护率为62.5%。二次免疫实验中,大鲵分别在第一次免疫7、14、21、28、56 d后进行第二次免疫。结果显示,第一次免疫21 d后进行二次免疫,其血清抗体效价可以较长时间维持在最高水平,最高血清抗体效价为274.37±25.23,第二次免疫后的第150 d用GSIV进行攻毒,存活率为86.67%。研究结果表明,大鲵虹彩病毒病灭活疫苗最佳免疫方式为腹腔注射疫苗0.2 mL/尾后,21 d进行第二次免疫,免疫剂量为0.2 mL/尾。

【目的】制备抗鸭坦布苏病毒（Ｄｕｃｋ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ，ＤＴｍｕｖ）Ｎｓ５蛋白的单克隆抗体。【方法】将实验室保存的ＰｅＴ２８ａ－Ｎｓ５载体转化入ｒｏｓｅＴＴａ（Ｄｅ３）感受态细胞中进行诱导表达，利用纯化的鸭坦布苏病毒Ｎｓ５蛋白作为抗原免疫ｂａＬｂ／ｃ小鼠，应用淋巴瘤细胞杂交技术结合有限稀释法制备单抗，并对单抗的特异性、反应性及其抗原表位和亚类进行鉴定。【结果】筛选获得２株稳定分泌针对ＤＴｍｕｖ的Ｎｓ５蛋白单抗的杂交瘤细胞，分别命名为ａ４Ｄ１和ｂ４ｂ８。此２株杂交瘤细胞诱导ｂａＬｂ／ｃ小鼠的抗体效价均可达到１∶６４ ０００。间接ｅＬｉｓａ、ＷｅｓＴｅｒＮ ｂＬｏＴ和间接免疫荧光（ｉＦａ．．．

18周龄SPF种鸡在用网状内皮增生病病毒(REV)弱毒疫苗免疫接种后,均在11 d内产生REV特异性抗体。种鸡在免疫后1~15 d内均未检出病毒血症。在开产后在5个月的产蛋期内,来自免疫种鸡的雏鸡100%REV母源抗体阳性。对3日龄雏鸡的攻毒试验表明,相对于无母源抗体的SPF鸡,REV母源抗体能有效地预防或减弱经接种REV低代毒造成的生长迟缓、中枢免疫器官萎缩及其对NDV和AIV灭活疫苗免疫后抗体反应的抑制作用。

应用荧光定量PCR技术,研究了嗜水气单胞菌疫苗浸泡免疫后,鳜(Siniperca chuatsi)鳃、皮肤、脾脏和头肾中IgM基因表达量变化,同时应用ELISA检测皮肤黏液和血清中抗体滴度变化。结果显示:最早检测到IgMmRNA转录水平上调的是皮肤和鳃(第4天),而脾脏和头肾在第7天才达到高峰。IgM基因在头肾和脾脏中表达量较高(高峰值分别达到16.3和23.8),皮肤和鳃中的表达量较小(高峰值分别为4.3和8.6)。抗体效价方面,皮肤黏液中抗体滴度峰值出现时间较早(第7天),但抗体从开始形成到消失持续时间较短(28 d);血清中抗体滴度峰值出现时间较迟(第21天),但持续较长(42 d)。结...

制备了牛轮状病毒甲醛灭活疫苗,以小鼠和兔子为模型检测其免疫原性。将本室分离鉴定的牛轮状病毒野毒株(CHLY株)在恒河猴肾细胞系(MA-104)上增殖,制备病毒抗原液。当病毒的感染力达到106TC ID50/mL以上时,甲醛灭活,并分别制备油乳佐剂疫苗和铝胶佐剂疫苗,然后免疫试验动物,检测疫苗的免疫原性。小鼠免疫试验结果表明,第2次免疫后所有免疫组均产生了高水平IgG抗体,与对照组差异极显著(P0.05);兔免疫试验中,免疫组母兔产下仔兔血清中含有高水平的牛轮状病毒特异性抗体,与对照组差异极显著(P<0.01)。试验表明制备的牛轮状...

[目的]建立鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和弹状病毒(SCRV)二联灭活疫苗毒种库及种子批。[方法]以ISKNV-QY0910株和SCRV-GM1503株为原始毒种,扩繁10代(F1～F10)后检测各代病毒对鳜鱼脑组织细胞系(CPB)的致病性及其滴度,并检测其对鳜鱼的毒力。PCR扩增ISKNV的主衣壳蛋白(MCP)基因、RT-PCR法扩增SCRV G蛋白基因序列,检测ISKNV和SCRV毒种的特异性。对F1、F5和F10代ISKNV、SCRV毒种进行细菌、霉菌、支原体及鳜鱼蛙病毒(RANA)和神经坏死病毒(NNV)检测,检验毒种的纯粹性。分别将F1、F5和F10代ISKNV、SCRV病毒液用甲醛灭活后制备灭活疫苗,免疫鳜鱼21 d后攻毒,连续观察14 d,待鱼体稳定后统计死亡率并计算免疫保护率(RPS)。将ISKNV和SCRV毒种湿毒保存于-80℃冰箱,每6个月取3支检测病毒滴度,以确定毒种的保存期。[结果]各代次毒株感染CPB细胞后产生的CPE形态及病变速度基本相同,SCRV滴度为10~(8.58)～10~(8.875) TCID_(50)/mL,ISKNV滴度为10~(7.38)～10~(7.625) TCID_(50)/mL。F1、F5和F10代ISKNV按10~4 TCID_(50)/mL、SCRV按10~(6.5) TCID_(50)/mL对鳜鱼攻毒(每尾0.1 mL),致死率均超过90%。ISKNV和SCRV各代次毒种可分别扩增出1 300bp的MCP基因和1 500 bp的G基因,特异性良好。ISKNV、SCRV毒种无细菌、霉菌、支原体及鳜鱼蛙病毒和神经坏死病毒污染。各代次病毒灭活疫苗对鳜鱼安全有效,免疫保护率ISKNV可达92%以上,SCRV可达84%以上;湿毒-80℃保存,保存期为36个月。[结论] 10代以内ISKNV和SCRV的生物学特性稳定,可用于鳜鱼ISKNV和SCRV二联灭活疫苗的制备与检验。

【目的】将鸭坦布苏病毒ＢＺ＿２０１０株在ＳＰＦ鸡胚上进行连续传代致弱；旨在选育安全性高、免疫原性好的活疫苗候选毒株。【方法】以ＳＰＦ鸡胚为增殖宿主，将ＢＺ＿２０１０株连续传代，直至第１２０代；以１日龄雏鸭和３０周龄的产蛋种鸭为试验对象，对第１２０代次毒株（命名为ＶＣ２）的安全性进行评价；以１ｄ雏鸭为试验对象，对ＶＣ２株的返强情况进行评价；以１８周龄的种鸭为试验对象，对ＶＣ２株免疫后的中和抗体进行监测；以２５周龄的种鸭为试验对象，对ＶＣ２株免疫后的保护效果进行评价；利用ＲＴ－ＰＣＲ方法分别扩增ＢＺ＿２０１０株和ＶＣ２株的Ｅ基因和Ｎ５４Ａ基因，进行测序分析。【结果】传代病毒对鸡胚的平均死亡时间逐渐．．．

本研究分析了鳗弧菌(Vibrio anguillarum)O1/O2血清型二价灭活疫苗免疫大菱鲆后的抗体持续期和免疫保护期。以鳗弧菌O1血清型VAM003株和O2血清型VAM007株为抗原制备了福尔马林灭活二价疫苗,将疫苗按照三种剂量(10~7 cells/尾、10~8 cells/尾、10~9 cells/尾)以腹腔注射途径免疫大菱鲆,在免疫后3 d、7 d、14 d、30 d、60 d、90 d、120 d、150 d,用血清凝集实验检测了免疫鱼血清的VAM003和VAM007抗体效价,用攻毒实验检测了疫苗的免疫保护率(RPS)。结果显示,在免疫后7 d三个剂量组的大菱鲆均产生了特异抗体,并获得27%～60%的RPS。三个剂量组大菱鲆的O1血清型抗体持续期分别>90 d (10~7 cells/尾组)、>150 d (10~8 cells/尾组)、>150 d (10~9cells/尾组),而三个剂量组大菱鲆的O2血清型抗体持续期均>150 d。三个剂量组的大菱鲆获得的免疫保护持续期均>150 d;以RPS>75%为有效免疫保护,各剂量组大菱鲆抵抗O1血清型病原感染的有效免疫保护期为:14～120d(10~7 cells组)、14～120 d (10~8 cells/尾)、14～150 d (10~9 cells/尾),抵抗O2血清型病原感染的有效免疫保护期为:14～60 d (10~7 cells组)、14～120 d (10~8 cells/尾)、14～120 d (10~9 cells/尾)。研究结果表明鳗弧菌二价灭活疫苗可为大菱鲆提供有效而稳定的免疫保护,获得的抗体持续期和免疫保护期为该疫苗的临床中试研究提供了基础。

[目的]2012年10月徐州地区某鸭场的樱桃谷种鸭突然发生产蛋下降,疑似鸭坦布苏病毒病。为了确诊病因,本试验进行了剖检与病原的分离鉴定。[方法]将病料匀浆处理后尿囊腔接种SPF鸡胚,分离病毒,接种BHK细胞培养,应用RT-PCR扩增病毒全基因,测序并进行基因进化分析。[结果]分离到一株鸭坦布苏病毒,命名为DTMUV XZ-2012株。该病毒株能适应鸡胚,无血凝活性,在BHK-21细胞上第5代的病毒滴度为5×104PFU·m L-1。测序结果表明该病毒株基因组全长为10 990 nt,编码的多聚蛋白含3 426个氨基酸。DTMUV XZ-2012株与BYD株、YY5株和JS_2010株等分离株的...

旋转培养优于静置培养,它不仅表现在可形成细胞单层的面积大,单层细胞的产量高,单位面积所需的培养液(维持液)少,而且细胞生长的速度较快,细胞形成单层的时间较短,接种病毒后收获的病毒滴度也相应较高,它适宜于疫苗工厂化生产。

【目的】比较鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus, DTMUV)分离株的毒力、分析E蛋白基因序列、研究抗原差异性,为鸭坦布苏病防控提供依据。【方法】将DTMUV-HB(2011)、DTMUV-AH(2014)、DTMUV-GX1(2012)、DTMUV-GX2(2015) 4株病毒接种10日龄易感鸭胚进行增殖,并利用6日龄SPF鸡胚测定ELD_(50)。根据测定的病毒含量,将分离毒株稀释为100ELD_(50)/0.5m L,人工感染40只180日龄健康北京鸭,进行临床症状观察、病毒分离、大体剖检,分析分离毒株的毒力有无差异。提取8株DTMUV分离病毒株的RNA,通过RT-PCR扩增E基因,分析比较不同地区的DTMUV的E基因核苷酸和氨基酸序列相似性,构建进化树。利用实验室建立的鸭坦布苏病毒血凝抑制试验分别测定4株病毒阳性血清对4株病毒的HI效价。同时采用固定病毒稀释血清法,利用C6/36细胞测定4株病毒阳性血清对4株DTMUV的血清中和效价。通过交叉血凝抑制试验和血清交叉中和试验比较4株病毒的抗原差异性(R值)。【结果】(1)各毒株的病毒含量范围在10~(4.7)—10~(5.3) ELD_(50)/0.1m L。人工感染鸭试验,攻毒后3 d鸭采食量和产蛋量均显著下降,各组病毒分离阳性率均在85%以上,剖检病变主要表现为卵泡变形、出血。(2)分离株序列分析结果表明,核苷酸序列相似性为95.7%—100%,推导氨基酸序列相似性在98.2%以上。遗传进化分析表明共同构成了一个进化分支。(3)4株病毒及其阳性血清进行血凝抑制交叉试验,计算的抗原性差异R值在0.79—1.12之间;进行细胞中和交叉试验,计算的R值在0.79—1.20之间。【结论】分离的4株DTMUV在毒力、E蛋白基因和抗原性上未见显著差异。