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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
苏小东 曹瑞兵 张羽 刘文娟 陈昊 祝长青 陈溥言
鸭圆环病毒(DuCV)是新发现的一种感染鸭的最小病毒,可导致鸭淋巴组织损伤。目前尚无检测其抗体的商品化ELISA试剂盒。为了对鸭群进行DuCV血清流行病学调查,本试验用原核表达了全长DuCV Cap蛋白,Western blot检测证明表达产物具有良好的抗原性。以纯化的重组Cap蛋白作为包被抗原,应用30份DuCV抗体阴性血清和16份DuCV抗体阳性血清,建立了检测DuCV抗体的间接ELISA方法,以此方法对从江苏地区收集的部分鸭血清样品进行检测,结果显示DuCV抗体阳性率为26.7%(38/142)。试验证明该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,且方法的变异系数均小于10%。结论:该方法操...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李坤 温国元 罗青平 商雨 艾地云 罗玲 王红琳 杨峻 邵华斌 程国富
建立了检测猪圆环病毒2型血清抗体的间接ELISA方法,并初步应用于临床血清样品的检测。用PCR方法从PCV2 HBZX株中获得截短的核衣壳(capsid,Cap)基因,将该基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-Cap,将该重组质粒转化宿主菌E.coliBL21-CodonPlus(DE3),用IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot鉴定蛋白的正确表达,表达蛋白Cap分子质量为42 ku,可与6×HIS抗体反应;KCl预染切胶纯化目的蛋白,以其为抗原建立检测PCV2感染猪血清抗体的间接ELISA方法。ELISA检测5份血清样品结果变异系数均小于10...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
葛猛 屈泰龙 罗维 李杰 周洪锐 余兴龙
为建立检测PCV2抗体的间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),将猪圆环病毒2(porcine circovirus type 2,PCV2)结构蛋白Cap(不含核内化信号肽)的基因克隆到原核表达载体pET 28a(+)中,并在大肠杆菌中表达,获得可溶性的重组蛋白(Cap⊿41),用Cap⊿41作为诊断抗原,确立了间接ELISA的最佳反应条件,并对来自4个猪场的394份血清进行检测。结果表明,与免疫荧光检测相比,建立的间接ELISA的检测敏感性和特异性分别为93.14%和95.72%,且建立的间接ELISA的批内与批间差异较小。此...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
车勇良 石运通 陈少莺 王隆柏 魏宏 吴振糜 庄向生 陈如敬 周伦江
为了检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)抗体,本试验建立了快速、敏感的ELISA诊断方法.通过比较差速离心、蔗糖不连续梯度离心、氯化铯等密度梯度离心和氯仿抽提结合超速离心等4种方法纯化PCV2抗原的包被效果,来确定最佳的PCV2包被抗原纯化方法,在此基础上,通过全病毒抗原最适包被浓度和二抗HRP-SPA稀释倍数的确定、待测血清稀释倍数的确定、封闭液浓度的确定、封闭时间的确定、HRP-SPA反应时间的确定、临界值的确定、特异性测定、重复性测定、符合率比较等,进一步优化检测PCV2抗体的间接ELISA方法.结果表明:对猪的多种病毒阳性血清进行ELISA检测,只有PCV2阳性血清呈阳性;对6份血清进行4次...
关键词：
猪圆环病毒Ⅱ型 ELISA方法 抗体
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
杨增岐 祝卫国 王旭荣 张涌
应用PCR扩增得到猪2型圆环病毒ORF2基因的3′端约600 bp,该PCV2 ORF2基因已去除终止子,并分别在其上下游添加Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点。PCR产物用Kpn Ⅰ和 Hind Ⅲ酶切后,与经同样处理过的 pBAD/g Ⅲ B Vector连接,转化TOP10细胞后挑取阳性克隆,经酶切鉴定和测序验证后用L-arabinose诱导进行融合表达,表达的蛋白主要以包涵体存在。经过镍离子亲和层析柱纯化,SDS-PAGE显示1条约28 ku的目的条带, 纯度达到85％以上。以该28 ku的多肽包被酶标板,建立了PCV2的间接ELISA检测方法。
[期刊] 华北农学报
[作者]
李鹏 郭军庆 金前跃 李青梅 李清州 万博 王选年 王川庆 张改平
根据PCV2 ORF1设计1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠReal-time PCR检测方法。该方法灵敏度可达10~100拷贝/μL,比常规PCR检测方法灵敏度高10倍,而与猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)以及猪细小病毒(PPV)没有交叉反应,利用该方法从50份临床病料中检测出43份阳性PCV2病毒,阳性检出率为94%。与常规PCR比较结果显示,该方法具有较高的灵敏度和特异性,能够快速检测和监控PCV2的感染流行。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
叶宝宏 鲍长磊 付明哲 许信刚
【目的】建立产气荚膜梭菌β毒素抗体间接ＥＬＩＳＡ检测方法。【方法】将原核表达重组质粒ｐＥＴ－２８Ａ－β转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞，用ＩｐＴＧ进行诱导表达，表达产物经镍柱亲和层析纯化、尿素梯度透析复性后进行ＷＥＳＴＥｒｎ ＢＬｏＴ鉴定。用复性的β毒素重组蛋白作为包被抗原，通过优化间接ＥＬＩＳＡ试验条件，建立其抗体间接ＥＬＩＳＡ检测方法，对该方法的特异性、敏感性和重复性进行考察，并用其对５２１份临床样本进行检测。【结果】通过诱导、纯化和复性，获得了纯度较高且具有良好反应原性的β毒素重组蛋白。间接ＥＬＩＳＡ条件为：抗原最佳包被质量浓度为５．０μＧ／ｍＬ，阳／阴性血清最佳稀释度为１∶５０．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
霍宁宁 朱伟英 高洋 杨雯昱 岳进华 赵燕清 陈德坤
【目的】建立羊伪结核棒状杆菌抗体的间接ＥＬＩＳＡ检测方法。【方法】分别用不同浓度的伪结核棒状杆菌菌体抗原和培养上清可溶性抗原包被酶标板，用脱脂奶粉封闭酶标板，设置封闭时间分别为１．０，１．５和２ｈ，再用不同稀释度的血清（１∶１００，１∶２００，１∶４００和１∶８００）与之反应，以此优化间接ＥＬＩＳＡ反应条件，确定阳性结果判定的临界值。对间接ＥＬＩＳＡ方法的特异性和重复性进行考察，并在此基础上对采集的临床样本进行检测。【结果】选用伪结核棒状杆菌菌体为包被抗原，最佳包被抗原菌体密度为ＯＤ６００＝０．０８，血清的最佳稀释度为１∶４００，封闭时间为２ｈ，阳性血清的临界值为０．３２９。该抗体检测方法可特．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
胡世享 叶玲玲 肖妍 卓娜 王滕芬 汪琳 蒲静 陈培富 艾军
为建立一种用于快速检测赤羽病病毒抗体的竞争ELISA法。用AKV病毒免疫Balb/C小鼠，将其脾细胞与SP2/0细胞进行免疫融合，以获得抗AKV的单克隆抗体；利用Bac-to-Bac杆状病毒表达的SBV N蛋白作为诊断特异性抗原，山羊抗鼠HRP-IgG为二抗，建立并优化AKV抗体检测的竞争ELISA方法。得到一株持续稳定繁殖的能够分泌单抗AKV核蛋白抗体的杂交瘤细胞株，单抗亚型鉴定为：重链IgG1,轻链kappa,仅能与AKV病毒呈阳性反应，与BTV、FAMD、EHDV病毒等病毒抗原不发生特异性反应；建立的检测AKV抗体ELISA检测方法，诊断抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,1∶1 000抗体稀释比，1∶50血清稀释比，1∶2 000二抗稀释比，封闭条件为5%BSA,37℃封闭2 h,确定了血清抑制率大于等于44%时为阳性，小于44%为阴性；所建立的ELISA方法敏感性和特异性鉴定结果与ID Screen AKV Competition检测试剂盒一致。本试验成功制备出一株分泌针对AKV N蛋白的杂交瘤细胞系，建立的ELISA检测方法能够用于检测动物AKV抗体，为进一步开展AKV抗体诊断试剂工艺研究、产业化奠定了基础。
关键词：
赤羽病 单克隆抗体 竞争ELISA
[期刊] 西南农业学报
[作者]
蒋文灿 郑林英
为了快速诊断和检测鸭肿头败血症病毒抗原,用分离自典型鸭肿头败血症的XD株病毒,制备鸭抗XD IgG、兔抗XD IgG,建立了检测鸭肿头败血症病毒(DSHSV)抗原的间接夹心ELISA法。试验的最佳条件为:抗体包被量为8μg/mL,封闭液为0.5%明胶,抗原孵育条件为37℃1.5 h,兔抗XD病毒IgG浓度5μg/mL,酶标羊抗兔抗抗体浓度为1∶2000,洗涤液为0.02 mol/LpH7.2 PBS。阴阳性结果判定的临界OD值为0.412。重复性试验显示变异系数小于10%。建立的间接夹心ELISA法不与鸭肿头败血症阴性抗原、鸭大肠杆菌抗原、鸭瘟抗原、鸭肝炎病毒抗原呈现交叉反应。敏感性比琼脂扩散...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
姜海军 陈琼 孔繁德 李国平 黄印尧 徐淑菲
参照GenBank收录的猪圆环病毒2型(PCV2)基因组全序列选择保守区域设计合成了引物及其探针,并对其进行了筛选;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqM an荧光定量PCR检测方法.用建立的检测方法对临床采集的组织病料进行了检测,并与常规PCR检测方法作比较.结果显示,所建立的方法灵敏度可达3×101拷贝.μL-1,比常规PCR检测方法灵敏度高10倍,而与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)没有交叉反应,具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点,适合于PCV2的流行病学调查和临床诊断.
[期刊] 华北农学报
[作者]
郭慧娟 李秀丽 张国伟 鄢明华 王利丽 张莉 孙英峰
通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了一种检测PCV2的SYBR Green荧光定量PCR方法。试验结果表明,该方法特异性强,与猪1型圆环病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等均无交叉反应。该方法最低可检测到10拷贝/μL的DNA,比PCR检测方法敏感性高1 000倍;其标准曲线线性范围是6.84×102~6.84×107拷贝,且具有良好的重复性。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
曹伟伟 郭抗抗 许信刚 宁蓬勃 刘伟 程敏 董玲娟 徐磊 高婉俊 任敏
【目的】建立一种能在临床上快速、准确检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)的TaqMan实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中已公布的PCV-2陕西分离株的全基因序列,在PCV-2的ORF2核苷酸序列的保守区域,设计合成1条TaqMan探针和1对特异性引物;利用设计的引物扩增ORF2部分基因并鉴定后,回收PCR扩增产物,连接pMD19-T载体,转化DH5α大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR及测序鉴定后提取质粒,作为荧光定量PCR的标准品;以标准品为模板建立检测PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法,并对该方法的灵敏度、稳定性和特异性进行评价;用建立的荧光定量...
[期刊] 华北农学报
[作者]
冯华 刘运超 陈玉梅 魏蔷 张改平
为了建立一种基于SYBRGreen的猪圆环病毒2型(PCV2)荧光定量PCR诊断方法,以PCV2 ORF2基因序列为研究对象,构建p MD19T-ORF2重组质粒作为阳性标准品,设计特异性引物,对该方法的最适引物浓度、退火进行了优化,并对该方法的灵敏度、特异性、可重复性以及临床样品检出率进行了评价。结果表明,该方法引物的最佳终浓度为0. 2 mol/L,最适退火温度为55℃;检测限可达到3. 0×10~2个拷贝/mL,而普通PCR检测限在3. 0×10~4个拷贝/mL;溶解曲线分析显示,在77~79℃有单一的溶解峰出现,并与CSFV、PPV、PRRSV、PRV没有交叉反应;组内重复性变异系数为0. 29%~0. 32%,组间变异系数为0. 32%~0. 36%;此外,该方法对临床样品的检出率为81. 5%(31/38),而常规PCR为68. 4%(26/38)。因此,相比常规PCR,该方法更为快速、灵敏、特异、稳定,更适合PCV2临床样品的检测,可为该PCV2早期感染的快速检测提供新方法。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
林而舒
为建立鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus,EeCV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法，根据EeCV复制相关蛋白(replication-associated protein, RAP)基因的保守序列设计特异性引物，并评价其灵敏性、特异性、重复性和应用效果。qPCR的阈值循环数(Cycle threshold value,C_t值)与标准品的拷贝数线性关系良好，且线性范围广(1.0×10~8～10~2拷贝数/μL);可特异性检测EeCV,而对鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus)、猪圆环病毒(Porcine circovirus)、鸭圆环病毒(Duck circovirus)无扩增；重复性强，组内和组间变异系数均小于3%;灵敏性高于普通PCR法10倍。且qPCR检测后发现，在感染EeCV的鳗鲡体内重要器官均可检测到EeCV,其中鳃的病毒量显著高于其他组织；对保存的44份疑似鳗鲡病毒性感染病料进行检测，阳性检出率为98%,而普通PCR法的阳性检出率为73%。
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