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[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
刘倩 唐亮 谈立松 赵玉军
为获得鸡VEGF基因片段,原核表达GST-cVEG基因,并对融合蛋白进行分离纯化,应用RT-PCR从鸡睾丸中扩增出VEGF片段,将PCR产物克隆至pMD 18-T载体。随后,将cVEGF片段亚克隆至带有GST的原核表达载体pGEX-4T-2中,测序鉴定。将重组质粒pGEX4T2-cVEGF转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导,并进一步通过Ni-NTA Agarose亲合层析纯化,纯化产物以SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,结果表明,成功地构建了原核表达质粒pGEX4T2-cVEGF。GST-cVEGF融合蛋白在大肠杆菌中得到了表达,Ni-NTA Agarose纯化...
关键词：
cVEGF 融合蛋白 原核表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
谭永安 肖留斌 孙洋 赵静 柏立新
【目的】克隆绿盲蝽超气门蛋白基因(ALUSP),获得原核表达的重组蛋白,为ALUSP的功能研究奠定基础,也为进一步解析绿盲蝽蜕皮及变态发育的机制提供理论依据。【方法】根据已知昆虫的USP基因序列设计简并引物,获得ALUSP的保守序列;再通过设计特异性引物,利用RACE方法,分别克隆ALUSP 5′及3′段序列,然后通过拼接获得ALUSP全长序列;应用生物信息学方法,对ALUSP基因序列特征及其所编码蛋白的特性进行分析,建立系统进化树;将含有ALUSP的T载体经EcoR I及Xho I双酶切,构建ALUSP原核表达载体pEGX6P1-ALUSP,将该表达载体分别在15、25、30和37℃条件下进...
关键词：
绿盲蝽 超气门蛋白 基因克隆 原核表达
[期刊] 中国水产科学
[作者]
孙婧 孙铂光 贾爱荣 张晓华
坎氏弧菌(Vibrio campbellii)是水产养殖动物的重要致病菌。本研究构建了坎氏弧菌热不稳定溶血素(TLH)基因的重组表达质粒pET26b(+)/tlh,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达带有6个组氨酸的TLH融合蛋白,然后利用Ni琼脂糖亲和层析柱进行纯化。SDS-PAGE分析显示,该溶血素能够大量表达,分子量约为42kD。纯化的TLH(0.41mg/mL)具有较强的溶血活性(溶血圈直径为16mm)及磷脂酶活性(晕圈直径为15mm)。其溶血活力的最适温度为37℃,在75℃下培养30min即丧失活力;最适pH为6,pH大于或小于6时都会导致其稳定性下降;一价金属离子如Na+、K...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
王文婷 张晨燕 赵可冉 丁建华 荆恩荣 杨超
【目的】双组分系统VfmH/VfmI与Dickeya属病原菌的致病因子和致病过程有关。研究D fangzhongdai Onc5菌株vfmH和vfmI基因的克隆、原核表达及蛋白纯化，为明确VfmH/VfmI的调控机理提供依据。【方法】采用RT-PCR方法扩增D. fangzhongdai Onc5菌株，获取vfmH和vfmI基因开放阅读框（ORF）。随后将目的基因克隆至原核表达质粒pET-32a，构建重组质粒pET-32a-VfmH和pET-32a-VfmI，经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后，利用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白，并利用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。【结果】D. fangzhongdai Onc5菌株vfmH和vfmI的ORF大小分别为1 401 bp和1 320 bp，分别编码466个和439个氨基酸；同源性分析表明，其氨基酸序列与Dickeya属其他菌种的vfmH和vfmI序列具有很高的相似性；SDS-PAGE和Western blot鉴定分析表明：添加0.5 mmol·L-1 IPTG，可诱导重组质粒pET-32a-VfmH转化株和pET-32a-VfmI转化株表达产生大量携带His-tag的融合重组蛋白；同时，成功纯化出目的蛋白。【结论】本研究首次克隆出D. fangzhongdai中双组分系统基因vfmH和vfmI，并成功纯化出VfmH和VfmI蛋白。
[期刊] 中国林业科学研究院
[作者]
曹佩
山鸡椒(Litsea cubeba(Lour.)Pers)是我国重要的天然香料树种,以果实为主要原料提取的山鸡椒精油在化工业、农业、制药业等行业有广泛应用,供不应求。山鸡椒精油主要成分萜类物质的合成途径及关键基因暂不清楚,萜类合成通路关键酶的研究可以为品种的遗传改良提供基因资源。山鸡椒精油以单萜与倍半萜为主要活性物质,目前在山鸡椒萜类合成通路上已陆续有关键酶基因被克隆鉴定,但其中具有竞争性关键调控作用的异戊烯基转移酶(IPS)尚缺乏了解。本研究基于山鸡椒果实发育过程的转录组数据,鉴定了来自LcIPS三个基
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
韩曜平 苏月菊 饶定齐 张志伟 夏德全 吴婷婷
从山溪鲵(Batrachuperus pachunii)皮肤匀浆液中经过Sephadex G-50凝胶过滤、AKTA(Resource Q阴离子柱和反向高压液相C4柱分离纯化得到相对分子质量为12 000的蛋白。利用其N端氨基酸序列设计引物,从山溪鲵皮肤的cDNA中克隆并筛选到该蛋白的cDNA序列。该cDNA序列的开放阅读框为339 bp,编码113个氨基酸残基组成的蛋白。在BLAST数据库搜寻比对分析表明,该蛋白的氨基酸序列与来自人类及其他哺乳动物β-microseminoprotein蛋白具有约40%的序列同源性。这也是首次在两栖类动物皮肤中确认β-microseminoprotein。初...
[期刊] 华北农学报
[作者]
付振艳 张正斌 王晓军 徐萍
NADP依赖的苹果酸酶(NADP-ME)是C4光合途径关键酶。为了确定TaNADP-ME1基因的功能,利用重组技术将前期克隆到的TaNADP-ME1基因构建到原核表达载体pET32a,双酶切和PCR鉴定阳性克隆,CaCl2法转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白。成功获得了重组原核表达载体pETE1,TaNADP-ME1基因在BL21(DE3)pLysS中得到了融合表达,SDS-PAGE表明,融合蛋白分子量为80 kDa,并成功纯化到融合蛋白。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李培培 张皛 潘小玫 王金生 宋从凤
TA3-13是小麦中一个冷胁迫蛋白WCSP1编码基因的5′端截短的DNA序列。它与水稻白叶枯病菌Harpin蛋白的编码基因hpa1_(X∞)(又称hrf1,hrfA)具有59%的一致性。为了研究TA3-13蛋白的生物学性状和功能及其与Harpin蛋白的关系,本研究以pET30a(+)为载体,构建了His融合表达重组体,转化大肠杆菌后在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和阿拉伯糖的诱导下获得了融合蛋白的表达。利用镍柱对融合蛋白进行了纯化研究,结果表明:融合蛋白在200 mmol·L~(-1)咪唑浓度下能够被有效地洗脱下来,电泳显示具有单一条带。烟草花叶病毒(TMV)接种试验显示:纯化的TA...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
王伟 白俊杰 劳海华 叶星 罗建仁
根据已报道的Mx蛋白cDNA序列设计合成特异引物,应用逆转录 聚合酶链式反应(RT PCR)方法,从草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)肝脏总RNA中扩增获得Mx蛋白cDNA,回收纯化后克隆到pGEM TEasyVector系统的T载体上。重组子的序列分析表明:所克隆的Mx蛋白cDNA长722bp,编码240个氨基酸,包括1个三联GTP结合区域和1个发动蛋白(dynamin)族特征的序列。与已知鱼类Mx蛋白基因序列比较表明,草鱼Mx蛋白基因序列与其它鱼类Mx基因相应序列具有较高的同源性,其中与斑马鱼Mx蛋白E型基因碱基序列比较同源性最高,为87...
关键词：
草鱼 Mx蛋白基因 基因克隆 原核表达
[期刊] 林业科学
[作者]
唐征 杨凯 冯永庆 曹庆芹 沈元月 秦岭
利用RACE技术从板栗短雄花序突变体中扩增得到660bp的板栗脂质转运蛋白(lipid transfer protein,LTP)cDNA片段。该cDNA编码118个氨基酸,具有8个位置保守的半胱氨酸(C)残基及26个氨基酸的信号肽,它与棉花、草莓脂质转运蛋白氨基酸序列相似性为63%,基因序列已提交数据库(GenBank),其登录号分别为FJ490676(基因)和ACL01093(蛋白)。荧光定量分析表明板栗短雄花序突变体较正常雄花序的脂质转运蛋白表达量更高。将板栗脂质转运蛋白基因插入到硫氧还蛋白融合表达载体pET32a(+)中,构建了板栗的原核表达载体pET-LTP,在大肠杆菌菌株Roset...
[期刊] 水产学报
[作者]
梁银龙 曹敏杰 郭川 苏文金 张凌晶 刘光明
通过分子生物学技术方法,分别克隆得到锯缘青蟹(Scylla serrata)、中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)和三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的原肌球蛋白基因序列。测序结果表明,三个基因的序列长度均为855 bp,编码284个氨基酸残基,三者氨基酸序列同源性为99.3%。三种蟹的原肌球蛋白基因序列与GenBank中其他甲壳类动物的原肌球蛋白具有很高的同源性。将锯缘青蟹的原肌球蛋白基因与pGEX-4T-3载体连接后,经IPTG诱导得到分子量约为61 ku的融合表达蛋白。通过与甲壳类过敏患者血清的免疫印迹反应,证实融合表达的原肌球蛋白具有过敏原性,...
[期刊] 海洋渔业
[作者]
刘晓玲 王振东 孙涵甜 王振华 赵振军 李忌
以栉孔扇贝(Chlamys farreri)卵巢cDNA为模板,采用PCR扩增Foxl2(forkhead box l2)基因,通过双酶切与pET-28a构建重组质粒表达载体,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,筛选鉴定阳性克隆,经测序鉴定后提取质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21,以IPTG诱导Foxl2蛋白表达,用SDS-PAGE鉴定表达情况,经镍柱纯化表达蛋白,通过免疫新西兰白兔(New Zealand white rabbits)制备多克隆抗体,以ELISA测定抗体效价,最后用WB(Western Blot)检测抗体特异性。结果表明,重组载体转化BL21后经1.0 mmol L~(-1)IPTG于37℃诱导6 h可产生大量Foxl2蛋白,主要以包涵体形式表达。经镍柱柱纯化可得到纯度较高的Foxl2蛋白,浓度达800 ug·mL~(-1)。免疫新西兰白兔获得多克隆抗体,效价大于1∶128 000。WB检测显示:该抗体能特异识别扇贝卵巢中的Foxl2蛋白,同时发现Foxl2蛋白在卵巢中强表达,而在精巢中几乎不表达,揭示栉孔扇贝中该蛋白具雌性性别相关性。研究成功获得效价高且能特异识别天然Foxl2的多克隆抗体,为后续深入研究Foxl2在栉孔扇贝卵巢中的功能提供了分子工具。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王娟 王桂萍 张红生 夏妍 沈振国
为研究耐铜植物海州香薷的金属硫蛋白(EhMT1)的结构与功能,运用分子生物学方法构建了pGEX-2T-EhMT1重组表达载体,经转化大肠杆菌BL21(DE3)后表达得到大小为33×103左右的融合蛋白GST-EhMT1,与预期结果一致。对融合蛋白诱导表达的温度、时间、IPTG诱导浓度等条件进行了优化,成功构建了能大量表达可溶性GST-EhMT1的优良原核表达体系。诱导表达的融合蛋白经GST-Sepharose亲和层析纯化后,每升菌液获得的可溶性融合蛋白高达70mg。用纯化的融合蛋白免疫新西兰雄兔,制备的抗血清经间接ELISA检测到较高的多克隆抗体效价。蛋白质印迹结果显示,纯化的蛋白质与兔抗血清...
关键词：
金属硫蛋白 原核表达 融合蛋白 抗血清
[期刊] 水产学报
[作者]
王梓璇 贾钊 邬恺正 朱晓真 王俊亚 冯浩 邹钧
为系统研究草鱼I型干扰素的合成、分泌和免疫功能，实验在大肠杆菌中表达并提纯了草鱼IFNa（CiIFNa）和IFNd（CiIFNd）重组蛋白。将CiIFNa和CiIFNd成熟肽分别克隆到pET-21d或pEHISTEVb表达载体上，并转化到大肠杆菌中；IPTG诱导表达获得CiIFNa和CiIFNd成熟肽的包涵体，经盐酸胍变性、蛋白复性和浓缩后，利用分子筛层析获得了纯度较高的重组蛋白。用重组蛋白免疫小鼠，通过PEG法诱导得到杂交瘤细胞；将稳定分泌抗体的阳性细胞株的细胞悬液注射入小鼠腹腔，制备腹水抗体并进行纯化。本研究纯化了草鱼CiIFNa和CiIFNd各2株抗体，并采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、酶联免疫吸附测定法（ELISA）、蛋白质印迹法（Western blot）和免疫荧光法对其进行了较全面的鉴定。研究结果表明，CiIFNa和CiIFNd单克隆抗体特异性好、效价高，能够特异识别在大肠杆菌和真核细胞中表达的重组蛋白，且不存在CiIFNa和CiIFNd分子间的交叉识别。本研究制备的单克隆抗体为深入研究草鱼干扰素的细胞来源和蛋白表达规律奠定基础。
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