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[期刊] 中国农业科学
[作者]
栗永华 车路平 仇旭升 谭磊 孙英杰 刘炜炜 宋翠萍 廖瑛 丁铲 王金泉 孟春春
【背景】TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR)是p53下游的靶基因,具有调节糖酵解水平和去除活性氧(Reactive oxygen species,ROS)并降低由活性氧诱发的细胞凋亡水平。【目的】构建鸡源TIGAR基因的真核表达质粒,并检测TIGAR基因在DF1细胞中的抗凋亡作用,为建立稳定表达鸡TIGAR基因的细胞系做准备。【方法】根据GenBank(登录号:XM_417232.6)中预测基因设计引物,利用RT-PCR的方法从SPF鸡脾脏中扩增鸡TIGAR基因,将扩增产物克隆至载体(Flag-CMV14)后送公司测序验证;随后构建进化树对鸡TIGAR基因与其他哺乳动物及水生动物的TIGAR基因进行同源性分析。将重组质粒(Flag-TIGAR)转染入DF1细胞24 h后,使用新城疫病毒诱导细胞凋亡,利用Western Blot检测重组质粒表达情况以及Poly ADP-Ribose Polymerase(PARP)裂解情况。此外还将重组质粒(Flag-TIGAR)转染入DF1细胞,并于收样前2 h使用Staurosporine刺激细胞发生凋亡,分别在转染后24、48 h收集样品,并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。【结果】RT-PCR扩增TIGAR基因,在843 bp处出现目的条带与预测相符,构建的TIGAR真核表达质粒(Flag-TIGAR)经测序,结果显示其序列与GenBank上预测的基本一致。Western Blot结果显示在30 h、36 h收集的样品中PARP均被裂解且转染重组质粒(Flag-TIGAR)的实验组与未转染质粒(MOCK)组或转染空载体(Flag-CMV14)组的样品相比,裂解的PARP表达量明显降低,且差异极显著(P
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
章世元 俞路 王雅倩 刘波 李治学 周联高 严桂芹 汪益峰 林显华
采集200日龄产蛋期新扬州鸡甲状旁腺组织,提取RNA并进行反转录聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物进行T-A克隆、测序。序列测定结果表明:PTH cDNA核苷酸长度为360bp。与GenBank上发表的鸡序列比较,核苷酸同源性为99.6%,在第159位处存在C→A的有意义突变。与从GenBank下载读取的牛、马、人、狗、猫、食蟹猴PTH基因序列进行比较分析,同源性分别为51.4%、50.8%、50.6%、50.3%、50.3%和46.9%。将该基因片段克隆到真核表达载体pCEP4,构建重组质粒pCEP4-PTH,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确,为利用pC...
关键词：
鸡 PTH 基因克隆 表达载体
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
安磊 孙婵 解芸菲 王勇 吕彬 孙超
【目的】探讨SOCS3对3T3-L1细胞凋亡的影响。【方法】以小鼠脂肪组织提取的RNA为模板,用RT-PCR扩增SOCS3基因,将其克隆至pMD18-T Simple,构建pMD18-T-SOCS3重组质粒,经测序验证后,以pMD18-T-SOCS3为模板扩增SOCS3基因,将其克隆至pEGFP-N1,构建真核重组质粒pEGFP-N1-SOCS3,测序正确后,将重组质粒pEGFP-N1-SOCS3转染3T3-L1细胞,荧光下观察GFP的表达,RT-PCR和Western blotting检测细胞内SOCS3mRNA和蛋白的表达,观察细胞凋亡的变化。【结果】测序表明,pMD18-T-SOCS3和...
关键词：
细胞凋亡 SOCS3 pEGFP-N1
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
邓明俊 张彦明 梁荣 段明星
为进一步研究基因疫苗的免疫机制和基因疫苗的免疫效果 ,应用 DNA重组技术 ,根据载体 pc D-NA4 .0 / His Max的多克隆位点设计引物 ,对含有 NDV保护性抗原基因 F的质粒 PCR扩增。将得到的目的片段插入到载体的启动子下游 ,成功得到含有 NDV F基因的真核表达质粒载体 PC4 F的基因疫苗。
关键词：
鸡新城疫病毒 F基因 基因疫苗
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
张立娜 刘培欣 曹殿军 闫丽辉 贾竞波 危艳武
以含有全长猪γ干扰素基因的质粒为模板,通过PCR方法扩增猪γ干扰素并引入酶切位点,酶切后与PCI真核表达载体连接在一起,测序后经比较,所扩增序列同Genebank报道的IFN-γ序列同源性为99·8%.将重组质粒转染PK细胞,检测所转染的pIFN-γ的抗病毒活性.试验结果表明,转染pIFN-γ试验组与正常细胞接毒对照组比较有显著差异,说明所构建的重组质粒转染后具有抗病毒作用.
关键词：
猪γ干扰素 真核表达 活性测定
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
彭树英 安志兴 张涌
为深入研究bcl 2对细胞凋亡的调控机制和肿瘤发生发展的影响,应用基因重组手段,根据表达载体pEGFP C1上的多克隆位点和bcl 2基因序列设计了1对引物,对含有bcl 2基因的质粒pWB bcl进行了PCR扩增,得到了708bp的目的片断。将其克隆到pMD18 Tvector,筛选阳性克隆并测序,序列分析表明,其与原初序列同源性达99%。将bcl 2插入到载体启动子下游,与报告基因绿色荧光蛋白(EnhancerGreenFluorescentProtein,EGFP)融合,经限制性内切酶酶切和PCR鉴定,证明Bcl 2/EGFP真核表达质粒构建成功。
关键词：
bcl2 绿色荧光蛋白 真核表达质粒
[期刊] 华北农学报
[作者]
张玉杨 张改平 乔松林 郭成留
利用本研究小组克隆的猪IgG Ⅱ类Fc受体cDNA(swFcγRⅡ)基因序列(DQ026064)设计引物,应用RT-PCR技术,从猪外周血白细胞cDNA中扩增了完整的960 bpswFcγRIIORF序列,利用基因重组技术将swFcγRIIORF基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3,经PCR及双酶切鉴定:扩增出901 bp的PCR产物;KpnI/EcoR I双酶切,切出5 376和901bp DNA片段,表明重组质粒pcDNA/swFcγRⅡ构建成功。然后脂质体法转染COS-7细胞,用玫瑰花环试验鉴定了swFcγRII配体亲和特性。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
贾红梅 常维山 宋文刚 柴家前 孙英峰
为了研究胸腺五肽基因的免疫增强作用,根据GenBank收录的新城疫病毒(NDV) F基因序列,设计1对特异性引物,其中上游引物含有胸腺五肽(Thymopentin,TP-5)的基因序列。以NDV Z株F基因的重组质粒为模板进行PCR扩增,扩增产物与真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO重组,构建了真核共表达质粒pcDNATP-5NDVZF。将重组质粒pcDNATP-5NDVZF、pcDNANDVZF分别以100μg/只的剂量免疫小鼠,用间接ELISA法和MTT法检测其免疫原性。结果表明,重组质粒均能在小鼠体内诱导相应的体液免疫和细胞免疫,其中pcDNATP-5NDVZF的作用较p...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
冉智光 童光志 张绍杰 王玉春 黄勇富
根据已发表的伪狂犬病毒（ＰｒＶ）的基因序列，在ＰｒＶｇＥ基因起始密码子和终止密码子的上、下游分别设计一对引物ＰＣＬ１和ＰＣＬ２，在ＰＣＬ１和ＰＣＬ２的５端分别加上ＫｐｎＩ和ＢａｍＨＩ位点，以ＰｒＶＭｉｎ－Ａ株ＤＮＡ为模板成功地扩增到约１．８ｋｂ的片段，经酶切鉴定为ＰｒＶｇＥ基因。将此ＰＣＲ产物以ＫｐｎＩ和ＢａｍＨＩ消化，回收后与经ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ酶解的ｐＵＣ１１９连接、转化，获得了明显大于载体的重组质粒，经限制性酶切和序列部分测定鉴定了阳性重组质粒ｐＲＺＥ。将ｐＲＺＥ分别经ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ酶切，回收ｇＥ基因，分别克隆到真核表达载体ｐＣＲ３－Ｕｎｉ和杆状病毒载体...
[期刊] 水产学报
[作者]
田丁 李珂珂 蒋飞 陈春秀 念子清 吴志新 陈孝煊
为进一步研究CD8α、CD207在草鱼树突状细胞(dendritic cells,DCs)中的功能，实验构建了草鱼CD8α、CD207基因重组真核表达质粒并在草鱼DCs中成功表达。采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从草鱼DCs中获得CD8α、CD207开放阅读框序列(ORF)，分别插入真核表达质粒pcDNA3.1，构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-CD8α、pcDNA3.1-CD207；经测序鉴定正确后，采用脂质体法将重组真核表达质粒分别转染至草鱼树突状细胞，经细胞免疫荧光技术和蛋白免疫印迹(Western blot)法验证CD8α、CD207的表达。结果显示，在蛋白免疫印迹实验中CD8α、CD207蛋白可正常表达，且大小与预测结果一致。细胞免疫荧光结果显示，CD8α、CD207蛋白主要在草鱼DCs的细胞膜上表达。本研究成功构建pcDNA3.1-CD8α、pcDNA3.1-CD207重组真核表达质粒，为后续研究CD8α、CD207基因在DCs中的作用机制奠定了基础。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
吴亚丽 徐倩 武志丹 潘梦梦 张剑 李新生
构建β半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶I(ST3GALI)基因的真核表达载体p IRES-ST3GALI,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达。以p GEM-ST3GALI质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增ST3GAL I基因,通过酶切和连接,构建真核表达载体p IRESST3GALI。经PCR、双酶切和测序鉴定正确后,转化筛选阳性重组大肠杆菌(DH5α),用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白,并用12%SDS-PAGE鉴定。结果表明,重组质粒p IRES-ST3GAL I中的ST3GAL I序列与原鸡的ST3GAL I氨基酸序列同源性98.8%,与猪的同源性达53.5%,与...
[期刊] 华北农学报
[作者]
俞路 王雅倩 章世元 卜祥斌 李治学
通过酶切方法自含鸡甲状旁腺素(CT)基因的克隆质粒pGEM-T-CT中扩增CT基因,并将其克隆到真核表达载体pCDNA3中,阳性克隆鉴定后,在PEI作用下转染COS-1细胞,通过间接免疫荧光试验(IFA)检测到了CT在COS-1中的表达。
关键词：
甲状旁腺素 转染 IFA
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
潘群兴 何孔旺 温立斌 郭容利 黄克和
应用基因重组技术,构建猪圆环病毒2型ORF2基因与白介素2基因(IL-2)的真核双表达载体并将其转染CHO细胞,通过RT-PCR、间接ELISA、Western-blot、间接免疫荧光检测(IFA)等方法验证基因的表达情况。结果表明:成功构建了猪圆环病毒2型ORF2基因和IL-2基因的真核双表达质粒pIRES-ORF2-IL-2,该质粒可在体外同时表达ORF2和IL-2。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张书霞 陈万芳 于勇 鲍恩东
用一步法从17 日龄来克亨SPF鸡胚和90 日龄成年鸡的法氏囊、脾脏和胸腺组织中提取总RNA(TRNA),用鸡B-细胞淋巴瘤/白血病-2基因 (bcl-2) cDNA探针进行Northern blot杂交。发现bcl-2 在成年和胚胎鸡的不同免疫器官中表达量不同, 成年鸡bcl-2 的表达量多少依次为胸腺、脾脏、法氏囊, 而胚胎鸡则是胸腺、法氏囊、脾脏。同时用流式细胞法测定这些器官的细胞凋亡情况, 胚胎鸡法氏囊、脾脏和胸腺的细胞凋亡率分别是0.40% , 0.68% 和0.38% ; 成年鸡则是6.98% , 1.17% 和0.61% 。结果表明, 鸡bcl-2 基因通过阻抑细胞凋亡直接调控正...
关键词：
bcl-2 鸡 免疫器官 表达 细胞凋亡
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郭锋 武琪 胡斌 王邦娟 赵子曼 贾梦岩 李哲 张艳红
[目的]探讨IBDV感染过程中凋亡相关基因启动子5-mC甲基化水平的变化,为揭示IBDV引起细胞凋亡的细胞内调节机制提供理论基础。[方法]采用21日龄母源性抗体检测为阴性的商品肉鸡,随机分为对照组(control)和病毒感染组(IBDV),病毒感染组肉鸡用IBDV CJ801毒液进行点眼滴鼻攻毒0.1 mL/只,对照组以同样方式给予PBS。IBDV感染后5 d收集法氏囊组织,采用HE染色观察法氏囊组织病理变化,采用qRT-PCR检测凋亡相关基因的表达,并应用MeDIP-PCR技术检测差异基因启动子的甲基化水平。[结果]与对照组相比,IBDV感染后5d肉鸡法氏囊出现明显的组织水肿,滤泡面积明显降低,滤泡中出现大量固缩细胞核。促凋亡基因Caspase-8和Caspase-3的表达极显著降低(P<0.01),抑制凋亡基因Bcl-2的表达极显著升高(P<0.01)。MeDIP-PCR发现,Caspase-3基因启动子的甲基化水平显著升高(P<0.05),而Bcl-2基因启动子的甲基化水平极显著降低(P
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