为获得具有生物活性的骨钙素蛋白,以鸡颅骨提取的总RNA为模板,RT-PCR法克隆鸡骨钙素成熟肽DNA,连接至原核表达载体pET-32a(+),构建表达质粒pET-32a(+)-rchOC。质粒转化Rosetta-gami(DE3)pLyS宿主菌,IPTG诱导表达含His标签的重组蛋白His-rchOC。肠激酶酶切去除融合蛋白中的His标签后获得重组骨钙素蛋白(rchOC)。通过与羟基磷灰石结合试验、MTT及PNPP法分析该蛋白生物学活性。结果显示:重组骨钙素蛋白能与羟基磷灰石结合,抑制成骨细胞中碱性磷酸酶的表达,但不影响成骨细胞的增殖。结论:经原核表达系统已成功获得鸡重组骨钙素蛋白,且该蛋白具...

【目的】检测重组鹅IFN-γ的生物学活性。【方法】将鹅IFN-γ成熟蛋白基因分别克隆到原核表达载体pET30a,杆状病毒转移载体pMelBacA和pBlueBacHis2A。对鹅IFN-γ成熟蛋白进行原核和真核表达系统表达;利用体外活性试验检测表达产物的生物学活性。【结果】原核和真核表达系统表达了重组鹅IFN-γ成熟蛋白,并制备其原核表达产物的多克隆抗体;重组鹅成熟IFN-γ可以诱导鹅巨噬细胞产生NO,并能抑制GPMV在鹅胚成纤维细胞中的增殖。【结论】重组鹅成熟IFN-γ具有鹅巨噬细胞激活活性和抗病毒活性。

为了在毕赤酵母中表达鸡骨保护素(chOPG),采用DNA重组技术将鸡OPG成熟肽cDNA片段插入毕赤酵母表达载体pPICZα-A中,以电穿孔法转化酵母X-33,用Zeoc in平板筛选阳性重组子,经甲醇诱导,实现了OPG在毕赤酵母中的分泌表达。SDS-PAGE电泳分析结果显示,表达产物存在两种形式,其相对分子质量分别为43000和53000,表达量约为200 mg.L-1,经免疫印迹验证,有较好的抗原性。表达产物经处理后加入到体外培养的鸡胚破骨细胞上,能显著抑制成熟破骨细胞的骨吸收活性,减少骨吸收陷窝的个数与面积。

【目的】体外真核表达梅花鹿(Cervus nippon)激活素A重组蛋白并测定其生物活性,为进一步明确激活素A在梅花鹿卵母细胞体外成熟过程中的生理学功能提供基础。【方法】利用RT-PCR技术克隆梅花鹿激活素βA (ActivinβA, ACTBA)亚基基因的cDNA全长序列,同时利用生物信息学对梅花鹿激活素βA的基因特征进行分析。在NCBI数据库下载其他物种激活素βA同源序列,利用Clustalx和MEGA 4软件进行同源比对并构建进化树。构建pcDNA4/ACTBA重组质粒并转染至CHO细胞内,进行目的蛋白的体外表达。采用免疫荧光及Western blot技术对目的蛋白表达情况进行检测,并通过Ni-NTA亲和层析柱对蛋白产物进行纯化。采用Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中的SMAD2和SMAD3的磷酸化水平。最后采用荧光定量PCR及Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中类固醇激素合成相关酶的表达量。【结果】克隆得到的梅花鹿ACTBA亚基基因含有1 278 bp的碱基,编码426个氨基酸。同源性比较发现梅花鹿ACTBA基因与牛的ACTBA基因同源性最高达98.4%同源。进化分析表明该基因与同为偶蹄目动物的反刍兽牛和山羊亲缘关系最为接近。经酶切、PCR和测序方法鉴定,成功构建真核表达质粒pcDNA4/ACTBA。免疫荧光显示该质粒在CHO细胞中主要定位在细胞质。Western blot结果显示激活素A的前体蛋白分子量约为58 kD左右。镍亲和层析纯化后的激活素A重组蛋白显著增加SMAD2和SMAD3的磷酸化,表明激活素A可以激活SMAD信号通路。同时成熟的激活素A重组蛋白可以诱导猪颗粒细胞芳香化酶(Aromatase)蛋白表达量上调,类固醇生成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)表达量下调,FSH受体基因表达量升高,LH受体基因表达量降低,但胆固醇侧链裂解酶(Cholesterolside-chaincleavageenzyme,CYP11A1orP450scc)及3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-Hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)基因表达量不变。结果表明梅花鹿激活素A重组蛋白可以增强FSH对颗粒细胞的生物学作用,也可以减弱LH对颗粒细胞的生物学作用。【结论】成功构建了激活素A蛋白的真核表达载体,并获得了较高纯度的、具有生物学活性的梅花鹿激活素A重组蛋白,为下一步激活素A蛋白的生物学功能和生理学机制研究奠定了基础。

利用含有重组噬菌粒的噬菌体直接侵染大肠杆菌(Escherichia coli)HB2151,原核分泌表达了抗苏云金芽孢杆菌(Ba-cillus thuringiensis,Bt)Cry1B毒素蛋白的单链抗体(single chain-variable fragment,scFv),经纯化、鉴定抗原结合活性后,建立了Cry1B毒素蛋白的ELISA检测方法。方法以展示scFv抗体的重组噬菌体感染E.coli HB2151,经PCR和基因测序检测克隆scFv基因片段的完整性,用SDS-PAGE方法检测scFv在E.coli HB2151宿主菌中的表达水平,用ELISA测定法检测scFv的抗原结合活性...

通过SOE-PCR技术获得PstS基因全长并克隆到pColdⅠ,将重组表达载体pCold-PstS转化进BL21(DE3)后经IPTG诱导表达融合蛋白PstS,将其纯化后免疫新西兰兔制备多克隆兔抗血清，提取鸡毒支原体总蛋白、膜蛋白和胞浆蛋白，通过Western blot分析PstS蛋白的亚细胞定位.结果表明，PstS基因长度为1 065 bp,其蛋白在氨基酸9～31之间存在跨膜区，pCold-PstS经诱导表达获得融合蛋白PstS(存在于细胞膜和胞浆中),其约43 ku并具有较好的抗原性. PstS蛋白是鸡毒支原体膜表面的免疫原性蛋白，可为进一步研究其生物学功能和基因工程疫苗提供依据.

【目的】鸭瘟和小鹅瘟是番鸭和鹅的两种重要传染病，鸭瘟最主要的防治措施是定期接种鸭瘟病毒减毒活疫苗。根据２０１２年国际病毒分类委员会（ＩＣＴＶ）的报告，ＤＥＶ被归为疱疹病毒科的α疱疹病毒亚科马立克氏病毒属。疱疹病毒如伪狂犬病毒、马立克氏病毒、火鸡疱疹病毒等已广泛用于病毒活载体的研究，而近几年也有关于鸭瘟病毒（ＤＥＶ）作为疫苗活载体的报道。为了为免疫防控鸭瘟和小鹅瘟提供新手段，本研究拟在鸭瘟病毒疫苗株感染性克隆的基础上，构建表达小鹅瘟病毒（ＧＰＶ）主要免疫原蛋白ＶＰ２的重组病毒ｒＤＥＶ－ＶＰ２，并研究其生物学特性，进而探讨重组病毒ｒＤＥＶ－ＶＰ２作为防治ＤＥＶ和ＧＰＶ的二联重组活载体疫苗的可能性。．．．

【目的】骨保护素(OPG)是一种新发现能抑制前体破骨细胞分化及成熟破骨细胞活性的蛋白,本文旨在从体外扩增、表达鸡骨保护素(chOPG)蛋白,并制备其多克隆抗体,为深入研究它的生物学功能奠定基础。【方法】以体外培养的鸡胚成骨细胞中提取的总RNA为模板,利用RT-PCR方法,扩增出chOPG基因,测序后克隆至原核表达载体pET-32a(+),成功构建了原核表达质粒pET-32a(+)-OPG,重组质粒转化Rosetta-gami(DE3)pLysS,经IPTG诱导表达。【结果】表达产物经SDS-PAGE电泳,发现目的蛋白大小约为63kD,占菌体总蛋白的11.9%,Western blotting分...

将口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白基因P1的完整cDNA序列插入原核表达性载体pET-28α(+)中,获得融合表达质粒pET-P1,转化E.coli.BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE结果表明,pET-P1获得融合表达,Western Blot检测证实表达的融合蛋白具有免疫活性,表达产物主要以包涵体的形式存在,进一步采用纯化试剂盒纯化P1蛋白做为诊断抗原。

【目的】研究鸡源重组抗菌肽Fowlicidin-3的生物学特性,并为重组抗菌肽在临床上的应用奠定基础。【方法】根据抗菌肽数据库中Fowlicidin-3的氨基酸序列,选用毕赤酵母的偏嗜密码子,设计抗菌肽的基因,通过SOE法合成得到全长为114bp的Fowlicidin-3基因。将Fowlicidin-3基因克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-F。将线性化重组表达载体pPICZα-A-F通过电击法转入毕赤酵母宿主菌X-33中,构建分泌型重组酵母表达菌株。【结果】获得分泌型重组酵母表达菌株,Fowlicidin-3多肽表达量达到170mg·L-1,对致病性大肠杆...

【目的】探究我国重要入侵生物扶桑绵粉蚧(Phenacoccus solenopsis Tinsley)钙调蛋白基因(PsCam)在各虫态中的表达差异及PsCam蛋白在体外的异源表达,为进一步揭示PsCam的生理功能提供参考。【方法】克隆PsCam基因的ORF,推导其编码的氨基酸序列,采用生物信息学方法,分析扶桑绵粉蚧钙调蛋白的结构。构建PsCam原核表达载体,将其转化到大肠杆菌中进行诱导表达,并对产物进行纯化。采用实时荧光PCR方法,分析该基因在扶桑绵粉蚧各个虫态中的相对表达量。【结果】扶桑绵粉蚧钙调蛋白基因的氨基酸序列分析结果显示,该蛋白没有信号肽,具有2个EF-hand钙结合结构域,有13...

为了揭示hrp基因表达的Harpins蛋白能够广泛地诱导植物对植物病虫害防卫反应的分子机制,通过琼脂固体平板法,发现胡萝卜软腐欧文氏菌Ecc36菌株具有很高的胞外酶分泌活性,该菌接种非寄主植物烟草,能够引起过敏反应(HR),结果表明,Ecc36携带hrp基因。用地高辛标记的hrp N基因作探针,通过Southern杂交证明了Ecc36菌株中含有hrp N基因,命名为hrp NEcc PR基因;核苷酸序列分析表明,hrp NEcc PR基因的开放阅读框ORF为1 254 bp,编码的Harpin蛋白(命名为HrpN_(EccPR)蛋白)由417个氨基酸残基组成,其分子量为45.27 ku,等电点为5.73,与其他几种软腐欧文氏菌Harpin蛋白有较高的同源性。此外,将hrp NEcc PR基因克隆到表达载体p ET28a(+)上,将构建的hrp NEcc PR基因表达载体(p ET30a-Ecc PR)转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)诱导HrpN_(EccPR)蛋白表达,纯化后的HrpN_(EccPR)能诱导烟草发生过敏反应,表明HrpN_(EccPR)蛋白具有激发植物免疫反应的生物活性,可为进一步研究HrpN_(EccPR)蛋白诱导植物防卫反应的机制奠定基础。

根据梭鱼IL-22cDNA序列设计特异性引物,从梭鱼脾脏中扩增IL-22用于表达片段,连接至载体pUC57。分别以BamHⅠ和KpnⅠ对含有目的基因的质粒和pQE-30进行酶切,连接并转化到大肠杆菌M15中,以IPTG进行诱导表达。表达产物通过Ni-NTA亲和层析进行纯化。经SDS-PAGE对表达产物进行鉴定。SDS-PAGE显示该IL-22表达质粒经IPTG诱导后,IL-22重组蛋白主要在菌体培养上清中表达。通过优化蛋白表达及纯化方法,成功获得了梭鱼IL-22活性蛋白。

利用RT-PCR和RACE技术,以小菜蛾(Plutella xylostella)3龄幼虫的cDNA为模板,克隆获得泛素延伸蛋白基因Px-ubi(GenBank No.FJ527489),核苷酸序列全长537 bp,其中开放阅读框全长387 bp,编码129个氨基酸残基,预测分子质量为16.7 ku,等电点为9.1,与已知真核生物泛素延伸蛋白的同源性为92%～98%。RT-PCR结果显示Px-ubi在小菜蛾不同生长发育时期均有表达,其中卵期、3龄期和预蛹期含量较高,而成虫期含量较低。同源建模显示,Px-ubi的3D结构主要由1个α螺旋、4个β折叠以及β转角和不规则卷曲组成,4个β折叠两两反向平...

【目的】茶尺蠖(Ectropis obliqua)是中国茶区主要的鳞翅目害虫,其幼虫暴食性常给茶园带来巨大损失。鳞翅目昆虫雌雄个体间普遍存在着性信息素通讯环节,而茶尺蠖性信息素识别途径一直鲜有报道。论文旨在通过对茶尺蠖性信息素识别过程中的结合蛋白基因进行鉴定和功能研究,为茶尺蠖性信息素化学通讯和嗅觉信息识别传递机制提供理论依据。【方法】利用RT-PCR技术对从雄虫触角转录组数据中首次鉴定和发现的一个茶尺蠖信息素结合蛋白基因(pheromone-binding protein,PBP)2(EoblPBP2)