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[期刊] 中国农业科学
[作者]
李荣荣 和祯泉 鲍恩东 陈溥言
【目的】研究鸡源重组抗菌肽Fowlicidin-3的生物学特性,并为重组抗菌肽在临床上的应用奠定基础。【方法】根据抗菌肽数据库中Fowlicidin-3的氨基酸序列,选用毕赤酵母的偏嗜密码子,设计抗菌肽的基因,通过SOE法合成得到全长为114bp的Fowlicidin-3基因。将Fowlicidin-3基因克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-F。将线性化重组表达载体pPICZα-A-F通过电击法转入毕赤酵母宿主菌X-33中,构建分泌型重组酵母表达菌株。【结果】获得分泌型重组酵母表达菌株,Fowlicidin-3多肽表达量达到170mg·L-1,对致病性大肠杆...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
姚静 胡云峰 王艳 张风荣 侯加法
为了在毕赤酵母中表达鸡骨保护素(chOPG),采用DNA重组技术将鸡OPG成熟肽cDNA片段插入毕赤酵母表达载体pPICZα-A中,以电穿孔法转化酵母X-33,用Zeoc in平板筛选阳性重组子,经甲醇诱导,实现了OPG在毕赤酵母中的分泌表达。SDS-PAGE电泳分析结果显示,表达产物存在两种形式,其相对分子质量分别为43000和53000,表达量约为200 mg.L-1,经免疫印迹验证,有较好的抗原性。表达产物经处理后加入到体外培养的鸡胚破骨细胞上,能显著抑制成熟破骨细胞的骨吸收活性,减少骨吸收陷窝的个数与面积。
关键词：
鸡骨保护素 毕赤酵母 分泌表达 破骨细胞
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王秀青 张素芳 曹瑞兵 周斌 陈溥言
通过重叠区扩增基因拼接法(SOE)合成抗菌肽天蚕素B基因,并在其N端引入Kex2酶切位点。亚克隆天蚕素B并将3个亚克隆串联在一起,每个单体前都加上Kex2酶切位点,将天蚕素B以及串联体克隆至表达载体pPICZαA上,用SacⅠ酶切使之线性化,采用电击法转化毕赤酵母SMD1168,转化子用小瓶发酵。经Tricine-SDS-PAGE检测,在α信号因子的引导下,表达产物可以分泌到培养基中,且具有明显抑菌活性。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李荣荣 和祯泉 吕英军 鲍恩东 陈溥言
对重组X-33毕赤酵母菌株表达的鸡源Fowlicidin-3抗菌肽的条件进行优化,并研究了表达产物的生物学活性。结果表明:当含有重组酵母菌的BMGY培养基A600值达到5～6时,转接pH 6.0的BMMY培养基,每24 h补加2%甲醇,29℃条件下培养72 h,重组鸡源Fowlicidin-3抗菌肽获得高效表达,含量达到170 mg.L-1。采用琼脂孔扩散法对该抗菌肽的热稳定性、酸碱稳定性等特性进行分析,结果表明:鸡源Fowlicidin-3抗菌肽具有较强的热、酸稳定性;对致病性大肠杆菌K99、鸡白痢沙门氏菌和金黄色葡萄球菌CowanⅠ的最小抑菌浓度分别为3.12、1.56和1.56μg.mL...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
曹瑞兵 王艳 魏建超 陈溥言
亚克隆犬α1干扰素(CaIFN-α1)成熟蛋白编码基因并克隆到表达载体pPICZα-A,构建转移重组载体pPICZα-A-CaIFN-α。pPICZα-A-CaIFN-α经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。转化子经PCR分析鉴定后利用甘油增菌和甲醇诱导,实现了CaIFN-α1在毕赤酵母系统中的分泌表达。SDS-PAGE检测结果表明表达产物相对分子质量约为2.7×104,比其推导结果(约1.9×104)大,推测可能是发生了糖基化。酵母分泌表达的CaIFN-α1具有较高的抗病毒活性,约为1.45×106U·mL-1,蛋白含量约为96mg·L-1,比活性为1.49×107U·mg-...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
仇妍虹 李鹏 李斐 郑其升 曹瑞兵 周斌 陈德胜 陈溥言
参考家蝇防御素抗菌肽基因序列(AY260152)设计4条引物,用降落PCR方法获得家蝇防御素抗菌肽成熟肽基因。将基因克隆入酵母表达载体pPICZα-A,构建分泌型重组酵母表达载体pPIC-Des-HF,转化Pichia pastoris受体菌SMD1168,在醇氧化酶(AOX)启动子调控下,相对分子质量约5 000的重组抗菌肽Des-HF获得表达。抗菌试验结果表明,该表达产物对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性。以小鼠为试验模型研究重组抗菌肽对金黄色葡萄球菌的体内抗菌活性,试验结果表明,240μg重组Des-HF可分别保护小鼠免受10倍最小致死浓度的金黄色葡萄球菌(ATCC26003)和Cowan...
[期刊] 华北农学报
[作者]
皇甫海燕 燕孟娇 宋培玲 郝丽芬 皇甫九茹 贾晓清 李子钦
为探讨ＰＧＩＰ蛋白与ＰＧ的互作及ＰＧＩＰ基因在油菜抗黑胫菌病中的作用，根据Ｇｅｎ Ｂａｎｋ中油菜ＰＧＩＰ９、ＰＧＩＰ１５ＣＤＳ序列设计引物，并去掉信号肽序列，以接种黑胫病病原菌ＬｅＰｔｏＳＰｈａｅｒＩａ ＢＩＧＬｏＢｏＳａ（菌株ｎＭ－１）７ Ｄ后油菜叶片总ｒｎａ反转录的Ｃ Ｄｎａ为模板，ＰＣｒ扩增出ＰＧＩＰ９、ＰＧＩＰ１５除信号肽以外的编码区片段，并克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体Ｐ ＰＩＣＺαａ中构建重组质粒Ｐ ＰＩＣＺαａ－ＰＧＩＰ９、Ｐ ＰＩＣＺαａ－ＰＧＩＰ１５。重组质粒经单、双酶切、菌落ＰＣｒ筛选鉴定后热激化法转化酵母细胞ＰＭａＤ１６，再经ＺｅｏＣＩｎｔＭ的ＹＰＤ平板和菌落ＰＣｒ筛选鉴定．．．
[期刊] 淡水渔业
[作者]
吴慧 陶妍
NK-lysin是毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生的具有抗菌作用的多肽,在机体免疫系统中发挥重要作用,被认为是抗生素的理想替代品。NK-lysin的生物学功能主要由其成熟肽(m NK-lysin)决定。本文在已有斑点叉尾(Ictalurus punctatus)NK-lysin成熟肽原核重组表达载体p ET-32a(+)-m NK-lysin的基础上,通过PCR在m NK-lysin的5’端和3’端分别添加EcoRI和Xba I酶切位点,并在3’端添加6×His标签以便于纯化;扩增到的片段与表达载体p
[期刊] 中国农业科学
[作者]
汪洋 杨桂香 吴波浪 张万江 黄伟华 彭险峰
【目的】猪表皮生长因子(pEGF)具有刺激静止期猪卵母细胞的成熟以及刺激仔猪胃肠上皮细胞成熟的功能,从而可以提高母猪繁殖率和降低断奶仔猪的应激。因此开发猪表皮生长因子具有重要意义。【方法】用人工合成的pEGF基因为模板,用PCR扩增获得pEGF-6His片段,将其克隆到载体pPIC9构建重组质粒pPIC9-pEGF并电转化毕赤酵母。用斑点杂交法筛选多拷贝整合转化子即基因工程菌,用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白,纯化产物用抗His-tag的单克隆抗体进行蛋白质免疫印迹、氨基端测序鉴定、体外生物活性检测。【结果】斑点杂交法筛选中信号越强的转化子,甲醇诱导表达的目的蛋白含量越高。免疫印迹中可以观...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
李雯 陶妍
从鲤鱼鳃组织中分离克隆到一种新的g型溶菌酶同工型基因(CLYG).该基因的全长cDNA为558 bp,除去终止密码子,编码185个氨基酸,推断的氨基酸序列没有信号肽,含3个催化位点(谷氨酸73、脯氨酸86和天冬氨酸97),具有鱼类g型溶菌酶的基本特征.通过PCR方法在CLYG基因的5'和3'端分别引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点.扩增到的目的片段与表达载体pPICZαA连接构建重组表达载体pPICZαA-CLYG后,电转至毕赤酵母X-33,筛选得到的阳性转化子在1.0%甲醇、29℃、pH 6.0的条件下诱导
关键词：
鲤鱼 g型溶菌酶 毕赤酵母 重组表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
岳明 丁宏标 乔宇
【目的】通过构建毕赤酵母工程菌株,以期获得重组海藻酸裂解酶,并对其性质加以研究。【方法】采用PCR的方法,以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)基因组DNA为模板,克隆出约1.0kb的海藻酸裂解酶基因algL的成熟蛋白编码序列,并将其插入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K-algL。重组质粒线性化后用聚乙二醇(PEG)法导入毕赤酵母菌株GS115中表达。【结果】用甲醇诱导培养基进行摇瓶发酵,表达得到40kD的目的蛋白,酶活力达540U·ml-1左右。经测定,该重组酶的最适反应pH为8.5,最适反应温度为40℃...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
谢帝芝 刘臻 王赏初 张建设 肖调义 鲁双庆
根据GenBank数据库中登记的青鱼(Mylopharyngodon picens)生长激素(bcGH)基因序列(AF389238)设计特异性引物,采用RT-PCR技术扩增青鱼生长激素cDNA编码区,并通过定向插入含强启动子AOX I的表达载体pPIC3.5k、电击转入毕赤酵母GS115菌株、G418多克隆子筛选和测序验证等步骤进行了重组生长激素酵母菌诱导表达等相关实验,成功获得重组生长激素酵母菌(pPIC3.5k-bcGH重组酵母菌)。蛋白表达产物经SDS-PAGE和ELISA检测,在23 kD处发现一条与预期蛋白分子量大小一致的特异性条带,并且目的蛋白能与青鱼生长激素多克隆抗体特异性结合,...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
王树云 李江宇 高志强 谷强 蒲静 任彤 张伟 张旻 江育林 武勇 张利峰
根据Gen Bank中鲤春病毒血症病毒(SVCV)糖蛋白全基因序列设计特异性引物,以SVCV欧洲株病毒核酸为模板,通过RT-PCR方法获得欧洲株SVCV-G基因,克隆至p PICZαA,构建p PICZαASVCV1540表达质粒。以限制性内切酶Sac I线性化p PICZαASVCV1540后通过化学法转化毕赤酵母感受态细胞X33和GS115,添加1%甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物显示其分子质量为70 ku。Western Blot分析显示该蛋白可以被SVCV山羊多抗识别,表明目的蛋白具有反应原性。
关键词：
鲤春病毒血症病毒 糖蛋白 毕赤酵母
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李平 桑贤春 裴炎 何光华
【目的】大多数的植物防御素对不同的病原菌具有抗菌活性,其中来自苜蓿种子的防御素alfAFP的转基因土豆和番茄已经被证明对病原菌具有强抗病性。进一步研究该基因对稻瘟病、纹枯病、白叶枯病三大重要病害的抑制作用,对水稻抗病基因工程研究具有重要的意义。【方法】本试验将alfAFP构建到表达载体pPIC9K上,电转化毕赤酵母(GS115),再进行蛋白质的分泌性诱导表达,最后进行体外重组蛋白对水稻病菌的抑菌活性检测。【结果】通过15%的SDS-PAGE检测,得到大约6.5kD的重组蛋白。alfAFP融合蛋白对水稻纹枯病、稻瘟病和白叶枯病均具有一定的抑制活性,其中对纹枯病的作用最为明显。【结论】alfAFP...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
王娜 何成霞 邹强 苟兴华 陈松 吴昊俣 蔡心析 许天恒
【目的】人微小纤溶酶原是由261个氨基酸组成的肽链,位于人纤溶酶原第549～790位,含有纤溶酶原活性区域,被激活后具有纤溶活性,能够降解纤维蛋白。本文旨在优化人微小纤溶酶原cDNA在毕赤酵母中的表达条件。【方法】在NCBI中获取人微小纤溶酶原氨基酸序列,根据毕赤酵母密码子偏爱性原理,设计对应的DNA序列,然后进行人工合成。合成的基因序列经测序验证后酶切与表达载体pPICZαA连接形成重组表达质粒pPICZαA-mPlg,转入大肠杆菌JM109中扩增质粒,提取阳性菌落中的重组质粒,双酶切获得人微小纤溶酶原的表达单元,然后构建4拷贝(表达单元)pPICZαA-mPlg,单酶切线性化质粒。然后电转化导入感受态毕赤酵母SMD1168中,经表型筛选、PCR筛选阳性克隆,获得高表达人微小纤溶酶原工程菌。培养工程菌后,甲醇诱导工程菌细胞让人微小纤溶酶c DNA表达,用SDS-PAGE检查其分子量,发色底物法检测微小纤溶酶原活性,通过发酵条件优化提高人微小纤溶酶原的产量,用SP-Sepharose fast flow凝胶层析方法纯化目标蛋白。【结果】SDS-PAGE检测到符合人微小纤溶酶原分子量大小的蛋白条带,同时发色底物法检测出样品中含有纤溶活性,其水平达到90 U/mL。【结论】本文为后续进行大规模表达人微小纤溶酶原打下了基础。
关键词：
人微小纤溶酶原 甲醇诱导 发色底物法
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