【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到PMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测试验,评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系...

【目的】建立禽坦布苏病毒（ＡｖｉＡｎ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ，ＡＴｍｖ）ＴＡｑｍＡｎ实时荧光定量ＰＣｒ检测方法。【方法】根据ＡＴｍｖ非结构蛋白ｎｓ１的基因特征，设计特异性的引物和探针，建立基于ＴＡｑｍＡｎ探针检测ＡＴｍｖ的实时荧光定量ＰＣｒ检测方法，对其特异性、重复性进行检测。用建立的ＴＡｑｍＡｎ实时荧光定量ＰＣｒ检测方法和之前建立的ｒＴ－ＰＣｒ方法同时对临床１５份疑似ＡＴｍｖ感染的病料进行检测，计算其符合率。【结果】成功建立了检测ＡＴｍｖ的实时荧光定量ＰＣｒ检测方法，当ｎｓ１基因含量为（２．６７×１０２）～（２．６７×１０７）拷贝／μＬ时有良好的线性扩增，其扩增相关系数为０．９９８，扩增．．．

依据甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)外壳蛋白(CP)基因的保守区设计引物和TaqMan探针,经过对反应体系和反应条件的优化,建立了特异、灵敏、高效的SPFMV实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明:该方法能检测到目的病毒,标准曲线的斜率和相关系数分别为-3.307和0.998,扩增效率为100.6%。最低可检测到约5.46个拷贝的阳性质粒,灵敏度比常规PCR高2个数量级。建立的实时荧光定量PCR方法可用于田间样品的检测,为SPFMV的早期预警和流行学研究提供了技术手段。

为了建立一种快速检测小反刍兽疫病毒的方法。根据Gen Bank中公布的PPRV Nigeria75/1株H基因序列设计2对引物,PCR扩增出1 830 bpH基因,构建标准质粒p MD-18-H。以标准质粒优化反应条件,建立了小反刍兽疫病毒H基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。最优反应体系25μL:2×SYBR qPCR Mix 12. 5μL,模板DNA 1μL,特异引物各0. 2μL(0. 2μmol/L),DEPC H2O 10. 5μL;最佳反应条件:94℃2 min; 94℃5 s,57℃30 s,40个循环,Ct值与标准质粒模板浓度在3. 28×104～3. 28×10-2copies/μL 7个浓度梯度呈良好线性关系y=-2. 913x+36. 904,斜率为-2. 913,扩增效率120. 5%,相关系数R2=0. 994。建立的实时荧光定量PCR检测方法比普通PCR灵敏度高10 000倍,稳定性好,特异性强,对PPRV的准确诊断和定量检测具有重要意义。

利用PCR技术扩增出大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovirus,GSIV)主要衣壳蛋白(MCP)编码区长度为1 392 bp的片段,克隆到pMD19-T载体上,构建重组质粒pMD19-T-MCP。经PCR鉴定确认正确后,以10倍梯度稀释pMD19-T-MCP重组质粒,作为标准模板进行TaqMan实时荧光定量PCR扩增,制作标准曲线,建立了大鲵虹彩病毒的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。制作的标准曲线有极好的线性关系,且线性范围宽,相关系数为0.990 19。组内重复试验的CT值标准偏差为0.52%。检测结果显示,该方法对大鲵虹彩病毒的检测有高度的特异性,与锦鲤疱...

【目的】建立一种能在临床上快速、准确检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)的TaqMan实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中已公布的PCV-2陕西分离株的全基因序列,在PCV-2的ORF2核苷酸序列的保守区域,设计合成1条TaqMan探针和1对特异性引物;利用设计的引物扩增ORF2部分基因并鉴定后,回收PCR扩增产物,连接pMD19-T载体,转化DH5α大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR及测序鉴定后提取质粒,作为荧光定量PCR的标准品;以标准品为模板建立检测PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法,并对该方法的灵敏度、稳定性和特异性进行评价;用建立的荧光定量...

猪圆环病毒２型（ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ２，ｐｃｖ２），是感染猪ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ的一种单链ｄｎａ病毒。建立一种快速、灵敏的检测方法，对于ｐｃｖ２感染猪的筛选和疾病预防非常重要。根据ｐｃｖ２ ｏｒｆ２基因保守区，设计了荧光定量聚合酶链式反应（ｐｃｒ）引物，利用ｓＹＢｒ Ｇｒｅｅｎ作为荧光染料建立了一种定量检测ｐｃｖ２的ｐｃｒ方法。结果表明：该方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的优点，每微升的最低检测限低至１０１拷贝ｄｎａ。利用该方法对３４份ｐｃｖ２阳性临床样本进行检测，检测符合率为１００％，明显高于普通ｐｃｒ方法的５０．０％。因此，本研究建立的ｐｃｖ２实时．．．

【目的】建立一种实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)检测番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)的方法,用于测定田间植株样品及其传毒媒介烟粉虱(Bemesia tabaci)中To CV的含量。【方法】首先根据To CV次要外壳蛋白(minor coat protein,CPm)基因的保守区域序列,运用Primer 3.0在线软件设计To CV特异性检测引物To CVq F和To CVq R,并通过Primer-BLAST进行比对保证检测引物的特异性;其次分别以感染To CV、番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)的番茄样品为模板,应用该对引物进行To CV基因片段的克隆鉴定;将阳性克隆样品放入含有氨苄青霉素的LB液体培养基中扩大培养,并提取质粒,获得To CV质粒标准品,将To CV质粒标准品按10倍浓度梯度稀释,建立标准曲线;同样以按10倍浓度梯度稀释的To CV质粒标准品为模板,同时运用RT-q PCR和反转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),比较这两种方法检测To CV的灵敏度;最后应用该方法对田间采集的8份疑似To CV感染的番茄样品以及获毒24 h后的单头烟粉虱进行病毒检测,结合扩增曲线、熔解曲线和Ct值对待测样品中的带毒情况和带毒量进行测定。【结果】在感染To CV的番茄样品和阳性对照中,引物To CVq F和To CVq R均能够特异扩增出To CV CPm基因片段,目的片段大小为230 bp,而在感染TYLCV、TSWV的番茄样品、健康番茄样品和空白对照中,该对引物则无法扩增出特异性目的条带,说明该对引物特异性较强;构建To CV的RT-q PCR标准曲线结果表明,随着To CV质粒标准品模板浓度逐渐降低,Ct值出现递增趋势,并且在质粒标准品浓度2.7×103—2.7×109 copies/μL范围内,To CV标准曲线Ct值同质粒标准品浓度之间呈现良好的线性关系,扩增效率为100%,决定系数R2=0.9911,直线方程为y=-3.32×lgx+40.06(y代表循环阈值即Ct值,x代表质粒初始浓度),该曲线将用于To CV含量的测定。RT-q PCR灵敏度检测结果表明,该方法能够检测出的To CV质粒标准品最低浓度为2.7×103 copies/μL,而常规RT-PCR仅能够检测出2.7×105 copies/μL的病毒样品,通过RT-q PCR法检测To CV比常规RT-PCR法灵敏100倍。该方法能成功检测出田间植物样品携带To CV情况,8份疑似To CV感染的番茄样品中有6份携带To CV,同常规RT-PCR检测结果一致,结合标准曲线计算出感染To CV的番茄样品带毒量分别为2.48×105、2.21×105、7.97×104、3.74×107、3.37×107、2.78×106 copies/μL;烟粉虱获毒24 h后,携毒率为100%,单头烟粉虱最高带毒量为2.55×104 copies/μL,最低为6.46×102 copies/μL。【结论】建立的RT-q PCR检测To CV的方法特异性强、灵敏度高,可以实现植物样品和媒介昆虫携带To CV情况和病毒含量的检测,可为To CV的准确、有效监测和预警提供技术支持。

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒(PPV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中的PPVVP2基因序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR,扩增猪细小病毒VP2基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy载体中,构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg2+浓度条件进行优化,建立最佳的荧光定量PCR反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板,建立SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法,对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对临床60份疑似PPV病料进行检测,同时与血凝试...

为了建立一种快速检测镰孢菌属的方法。根据Fusarium翻译延伸因子(TEF-1α)基因序列,设计并筛选其特异性引物F8-1/F8-2,能从靶标基因组DNA中特异性扩增出大小为187 bp的目的片段,建立Fusarium荧光定量PCR(RT-PCR)检测体系的灵敏度比常规PCR高104倍,且特异性良好。利用该反应体系检测不同湿度环境下病残体和土壤病残体DNA含量的动态变化。结果表明:病残体及土壤病残体DNA初始拷贝数分别为6. 90×10~(11),1. 06×10~(12)拷贝数/g,经过温度27℃、80%湿度下处理30 d病残体DNA含量下降至5. 55×10~8和0拷贝数/g,而在温度27℃、20%湿度下含量分别为8. 04×10~9,1. 30×10~9拷贝数/g。因此,建立的Fusarium实时荧光定量PCR检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点,可以快速准确地定量检测病残体DNA的含量,为瓜类根腐病的早期预防和流行监测提供了有效的技术手段。

以真鲷虹彩病毒(Red-sea breamiridovirus,RSIV)主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)的基因保守片段为靶序列,利用Pri mer Express3.0软件设计定量PCR引物,建立了RSIV的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法。将RSIV MCP基因连接pMD18-T载体,构建重组质粒,经过梯度稀释后作为标准品,根据标准品拷贝数(X)与Ct值的关系绘制了标准曲线,为Ct=-3.1841gX+40.270,相关系数R2=0.9969。熔解曲线分析表明,定量PCR产物的Tm值为82.5℃。该方法的检测限为2.20×102拷贝/反应,对流行...

根据GenBank发表的猴痘病毒(AF380138)F3L基因全序列,设计并合成了引物和TaqMan、MGB探针,建立了F3L基因的荧光定量PCR检测方法。应用该方法可从人工合成的猴痘病毒F3L基因片段(48 048～48 509 bp)扩增典型的"S"型曲线,25μL反应体系检测灵敏度可达6.8拷贝,但不能从鸡痘、山羊痘等病毒中扩增出相应的扩增曲线。结论:本方法可快速、敏感、特异地检测猴痘病毒。

根据PCV2 ORF1设计1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠReal-time PCR检测方法。该方法灵敏度可达10~100拷贝/μL,比常规PCR检测方法灵敏度高10倍,而与猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)以及猪细小病毒(PPV)没有交叉反应,利用该方法从50份临床病料中检测出43份阳性PCV2病毒,阳性检出率为94%。与常规PCR比较结果显示,该方法具有较高的灵敏度和特异性,能够快速检测和监控PCV2的感染流行。

为克服现有小瓜虫病的显微镜检和PCR诊断等方法在该寄生虫的感染早期阶段和环境样本检测中存在的缺陷，建立特异性强、灵敏度高的多子小瓜虫PCR检测方法，实验根据多子小瓜虫线粒体COⅠ序列设计和筛选了一对引物，经过PCR程序优化、特异性、灵敏性验证以及临床和环境样品检测分析，分别建立了普通PCR和荧光定量PCR检测方法。结果显示，本研究获得的检测引物对多子小瓜虫有较高的扩增特异性，对同属纤毛虫类的草履虫、四膜虫和肠袋虫以及常见养殖鱼类宿主异育银鲫、草鱼、尼罗罗非鱼和团头鲂等样本均无扩增；扩增特异性和灵敏度都优于文献报道的方法。其中，普通PCR最低检测的样本浓度为掠食体2.67个/μL，荧光定量PCR在掠食体0.02个/μL时依然能有效检出，荧光定量PCR检测灵敏度高于普通PCR。研究表明，在临床样本和养殖水环境样本检测应用中，基于该引物的两种PCR方法表现出很高的一致性，能有效检出潜伏感染鱼体和养殖水环境中的多子小瓜虫。本研究所建立的多子小瓜虫的检测方法特异性强、灵敏度高，适用于淡水养殖中小瓜虫病的早期诊断和病原体的检测。

在GenBank中搜寻虹彩病毒蛙病毒属主衣壳蛋白(MCP)基因序列并进行多重比较后,利用其中的保守序列,设计引物和Taqman探针,建立了虹彩病毒蛙病毒属实时荧光PCR检测方法。对荧光PCR反应条件进行优化,评估该检测方法的特异性、稳定性和重复性,利用10倍系列稀释法检验其灵敏度并与常规PCR做了比较。结果显示,该方法对虹彩病毒蛙病毒属成员(新加坡石斑鱼虹彩病毒除外)的检测有高度的特异性,与淋巴囊肿病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒等其他水生动物病毒之间均无交叉反应,有良好的特异性,检测总DNA灵敏度为4.5×10-3pg/μL,比传统PCR的敏感度高出100倍,可对低病...