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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
邓明俊 张彦明 梁荣 段明星
为进一步研究基因疫苗的免疫机制和基因疫苗的免疫效果 ,应用 DNA重组技术 ,根据载体 pc D-NA4 .0 / His Max的多克隆位点设计引物 ,对含有 NDV保护性抗原基因 F的质粒 PCR扩增。将得到的目的片段插入到载体的启动子下游 ,成功得到含有 NDV F基因的真核表达质粒载体 PC4 F的基因疫苗。
关键词：
鸡新城疫病毒 F基因 基因疫苗
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王青 张彦明 王选年 张改平 胡建和 杨苏珍 赵东 邢广旭 徐彦召 赵光辉 段艳华
应用PCR扩增出新城疫病毒F基因,将其克隆入pGEM-T载体,测序。然后将NDVF基因与高效的真核表达载体pcDNA4/HisMax相连,构建NDVF基因重组真核表达质粒pc4F,采用Superfect转染试剂将pc4F瞬时转染COS-7细胞,应用细胞免疫组化法检测其在细胞中的表达情况。结果表明,F基因能够在COS-7细胞中成功表达。
关键词：
新城疫病毒 F基因 真核表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
符芳 姜北宇 张莉 高轩 张飚
参照NDVLa Sota株核酸序列(AF077761)设计1对引物,利用RT-PCR扩增F基因并得到了长为1 700 bp的片段,将其克隆到pGEM-T easy vector中,经酶切鉴定和测序后克隆进原核表达载体pET-32a,将重组表达质粒转化BL21(DE3),在IPTG诱导下表达约83 kd的融合蛋白,SDS-PAGE电泳和Western blotting检测证实该基因片段获得高效表达且表达产物具有免疫学活性。
关键词：
新城疫病毒 F基因 克隆 原核表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
李红丽 詹丽娥 张伟业 唐娟 陆冰洋 王彩先
以山西省农业科学院畜牧兽医研究所预防兽医研究室克隆的pG-F和pG-HN质粒为模板,PCR扩增麻鸡新城疫病毒SX-1株F基因和HN基因,并以由15个柔性氨基酸构成的柔性短肽作为Linker将F及HN基因片段体外连接,插入pCI-neo真核表达载体,构建麻鸡新城疫病毒SX-1株F基因和HN基因共表达载体pCI-F-HN,并在Vero细胞中转染表达,进行间接免疫荧光检测。结果显示,麻鸡新城疫病毒SX-1株F-HN组合基因在Vero细胞中得到较高水平的表达,在荧光显微镜下能够观察到较强的荧光,说明F-HN组合蛋白具有良好的反应原性。为下一步研究高效亚单位基因工程苗奠定基础。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
许宗丽 谢芝勋 谢丽基 刘加波 邓显文 谢志勤 庞耀珊 范晴 罗思思
设计了2对特异性引物,PCR扩增出鸭源NDV分离株GX2011/19的F基因和DuCV的Cap基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1,成功构建重组融合表达质粒pcDNA3.1-F-Cap。经酶切和测序鉴定正确后,将重组质粒pcDNA3.1-F-Cap转染Vero细胞,采用间接免疫荧光检测到目的基因的体外表达。将pcDNA3.1-F-Cap作为DNA疫苗对2周龄的SPF雏鸭以胸部肌肉多点注射的方式进行免疫。分3个实验组,每组接种剂量分别为100、200和300μg/只,另设2组为载体质粒空白组和灭活疫苗组。ELISA检测抗体水平,试验结果显示:各DNA疫苗免疫组的NDV抗体和DuCV抗体...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
贾红梅 常维山 宋文刚 柴家前 孙英峰
为了研究胸腺五肽基因的免疫增强作用,根据GenBank收录的新城疫病毒(NDV) F基因序列,设计1对特异性引物,其中上游引物含有胸腺五肽(Thymopentin,TP-5)的基因序列。以NDV Z株F基因的重组质粒为模板进行PCR扩增,扩增产物与真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO重组,构建了真核共表达质粒pcDNATP-5NDVZF。将重组质粒pcDNATP-5NDVZF、pcDNANDVZF分别以100μg/只的剂量免疫小鼠,用间接ELISA法和MTT法检测其免疫原性。结果表明,重组质粒均能在小鼠体内诱导相应的体液免疫和细胞免疫,其中pcDNATP-5NDVZF的作用较p...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
王泽仁 李新生 刘文杰 李燕 黄宗梅 崔保安
2009年12月从疑似新城疫的商品肉鸡中分离到一株具有血凝性的病毒,经血清学和RT-PCR鉴定,确认为鸡新城疫病毒。该纯化病毒的MDT(最小致死量引起所有鸡胚死亡的平均时间)为56 h,ICPI(1日龄SPF鸡脑内接种分离病毒致病指数)为1.76,ELD50(鸡胚半数致死量)为10-8.5;序列分析表明,该分离株F蛋白基因长1662 bp,编码553个氨基酸,推导的F基因氨基酸序列裂解位点为112R-R-Q-K-R-F117,具备强毒的典型特征。经对F基因的全序列分析,该病毒与鸡新城疫病毒F48E9株,La Sota株的核苷酸同源性分别为85.9%、83.4%,与TCQQ/Tianjin/08...
关键词：
新城疫病毒 鉴定 生物学特性 F基因
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
潘群兴 何孔旺 温立斌 郭容利 黄克和
应用基因重组技术,构建猪圆环病毒2型ORF2基因与白介素2基因(IL-2)的真核双表达载体并将其转染CHO细胞,通过RT-PCR、间接ELISA、Western-blot、间接免疫荧光检测(IFA)等方法验证基因的表达情况。结果表明:成功构建了猪圆环病毒2型ORF2基因和IL-2基因的真核双表达质粒pIRES-ORF2-IL-2,该质粒可在体外同时表达ORF2和IL-2。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
葛金英 温志远 高宏雷 王永 胡森 鲍恩东 王笑梅 步志高
【目的】重组新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)作为新型的活病毒载体疫苗具有巨大的优势和应用前景,本研究旨在探讨新城疫病毒作为防制传染性法氏囊病超强毒(very virulent infectious bursal disease virus,vvIBDV)及新城疫重组二联活病毒载体疫苗的可行性。【方法】采用单股负链RNA病毒反向遗传操作技术,救获野生型NDV LaSota疫苗株rLaSota及表达vvIBDV Gx株VP2基因的重组疫苗株rLaSota-VP2,分别经滴鼻点眼途径免疫SPF雏鸡,免疫后21d分别以vvIBDVGx超强毒和新城疫强毒进行攻击。【结...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
冉智光 童光志 张绍杰 王玉春 黄勇富
根据已发表的伪狂犬病毒（ＰｒＶ）的基因序列，在ＰｒＶｇＥ基因起始密码子和终止密码子的上、下游分别设计一对引物ＰＣＬ１和ＰＣＬ２，在ＰＣＬ１和ＰＣＬ２的５端分别加上ＫｐｎＩ和ＢａｍＨＩ位点，以ＰｒＶＭｉｎ－Ａ株ＤＮＡ为模板成功地扩增到约１．８ｋｂ的片段，经酶切鉴定为ＰｒＶｇＥ基因。将此ＰＣＲ产物以ＫｐｎＩ和ＢａｍＨＩ消化，回收后与经ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ酶解的ｐＵＣ１１９连接、转化，获得了明显大于载体的重组质粒，经限制性酶切和序列部分测定鉴定了阳性重组质粒ｐＲＺＥ。将ｐＲＺＥ分别经ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ酶切，回收ｇＥ基因，分别克隆到真核表达载体ｐＣＲ３－Ｕｎｉ和杆状病毒载体...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
栗永华 车路平 仇旭升 谭磊 孙英杰 刘炜炜 宋翠萍 廖瑛 丁铲 王金泉 孟春春
【背景】TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR)是p53下游的靶基因,具有调节糖酵解水平和去除活性氧(Reactive oxygen species,ROS)并降低由活性氧诱发的细胞凋亡水平。【目的】构建鸡源TIGAR基因的真核表达质粒,并检测TIGAR基因在DF1细胞中的抗凋亡作用,为建立稳定表达鸡TIGAR基因的细胞系做准备。【方法】根据GenBank(登录号:XM_417232.6)中预测基因设计引物,利用RT-PCR的方法从SPF鸡脾脏中扩增鸡TIGAR基因,将扩增产物克隆至载体(Flag-CMV14)后送公司测序验证;随后构建进化树对鸡TIGAR基因与其他哺乳动物及水生动物的TIGAR基因进行同源性分析。将重组质粒(Flag-TIGAR)转染入DF1细胞24 h后,使用新城疫病毒诱导细胞凋亡,利用Western Blot检测重组质粒表达情况以及Poly ADP-Ribose Polymerase(PARP)裂解情况。此外还将重组质粒(Flag-TIGAR)转染入DF1细胞,并于收样前2 h使用Staurosporine刺激细胞发生凋亡,分别在转染后24、48 h收集样品,并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。【结果】RT-PCR扩增TIGAR基因,在843 bp处出现目的条带与预测相符,构建的TIGAR真核表达质粒(Flag-TIGAR)经测序,结果显示其序列与GenBank上预测的基本一致。Western Blot结果显示在30 h、36 h收集的样品中PARP均被裂解且转染重组质粒(Flag-TIGAR)的实验组与未转染质粒(MOCK)组或转染空载体(Flag-CMV14)组的样品相比,裂解的PARP表达量明显降低,且差异极显著(P
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
章世元 俞路 王雅倩 刘波 李治学 周联高 严桂芹 汪益峰 林显华
采集200日龄产蛋期新扬州鸡甲状旁腺组织,提取RNA并进行反转录聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物进行T-A克隆、测序。序列测定结果表明:PTH cDNA核苷酸长度为360bp。与GenBank上发表的鸡序列比较,核苷酸同源性为99.6%,在第159位处存在C→A的有意义突变。与从GenBank下载读取的牛、马、人、狗、猫、食蟹猴PTH基因序列进行比较分析,同源性分别为51.4%、50.8%、50.6%、50.3%、50.3%和46.9%。将该基因片段克隆到真核表达载体pCEP4,构建重组质粒pCEP4-PTH,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确,为利用pC...
关键词：
鸡 PTH 基因克隆 表达载体
[期刊] 华北农学报
[作者]
李红丽 詹丽娥 乔忠 王彩先 陆冰洋
将麻花鸡副黏病毒ZH-1株毒种接种于11日龄SPF鸡胚,收集48~96 h死亡的鸡胚尿囊液。参考已发表的鸡源副黏病毒F基因序列,设计并合成了一对特异性引物,用以扩增麻花鸡副黏病毒ZH-1株F基因,预期扩增的F基因片段包含完整的开放阅读框。通过RT-PCR扩增出麻花鸡副黏病毒ZH-1株F基因片段,琼脂糖凝胶电泳回收、纯化,得到F基因片段,经EcoRⅠ和SalⅠ消化,将F基因克隆进入PCI-neo载体,转化大肠杆菌DH5α,挑选菌落,经限制性核酸内切酶SalⅠ和EcoRⅠ双酶切及PCR鉴定,结果证明重组真核表达载体PCI-neo-F构建成功,为下一步在哺乳动物细胞Vero细胞中表达打下良好的基础。...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
陈礼朋 王忠田 岳旭龙 王泽仁 高文明 李双亮 张宇耕 崔保安 李新生
【目的】对新城疫病毒(NDV)HN09-69株P基因进行克隆、序列分析和表达鉴定,为研究P和V蛋白的功能,及NDV新流行毒株的免疫预防提供理论依据。【方法】以HN09-69株NDV为研究对象,根据GenBank上发布的相关P基因参考序列设计引物,进行RT-PCR扩增、克隆和序列测定分析,将P基因的核苷酸序列与相关参考株的P基因序列进行比对分析并构建进化树。将P基因克隆到原核表达载体PET28a(+)中,得到重组质粒rPET28a(+)-P,将重组表达质粒转化到BL21(DE3)中诱导表达,用SDS-PAGE电泳和Western blotting检测表达情况。【结果】扩增出了HN09-69株P基...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
蒋静 孙建和 陆苹
应用Long and Accurate—PCR(LA-PCR)技术,扩增克隆了鸡传染性法氏囊病病毒上海超强毒(wIB-DV)的VP2—4—3基因。应用粘性末端连接策略,将VP2-4-3基因克隆人真核表达载体pALTER-MAX。经酶切鉴定,表明VP2-4-3基因为正向插入,位于CMV启动子下游。该真核表达质粒在脂质体的介导下转染Vero细胞,经特异性抗IBDV抗体的免疫荧光检测,发现在细胞内有特异蛋白表达。
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