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[期刊] 华北农学报
[作者]
裴沛 熊慧 崔鹏 关伟军 马月辉
为建立鸡小肠上皮干细胞(Intestinal epithelial stem cells,IECs)体外培养体系并对其进行生物学特性研究,取18日龄鸡胚,分离小肠获得IECs,在DMEM/F12培养基中培养并观察其形态。通过传代及生长曲线的绘制分析其增殖情况,并经形态学观察及细胞免疫组织化学、RT-PCR等方法对所得到的纯化后的鸡小肠上皮干细胞进行鉴定。结果表明,鸡IECs可在体外扩增培养,目前传代至P11,纯化所得的鸡小肠上皮细胞经形态学观察及免疫荧光、RTPCR法鉴定为阳性,由此可得出结论:鸡小肠组织中可以分离出IECs,且能够在体外增殖培养。
关键词：
鸡 小肠上皮干细胞 分离培养 鉴定
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王菊花 张粟子 刘丹丹 王佳明 刘琦 董静 周杰 薛秀恒
【目的】比较不同消化酶对鸡胚小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IECs)的分离和培养效果及细胞的热应激能力,为后续研究提供依据。【方法】以15日龄鸡胚为研究对象,分别使用0.5 g/L胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合及中性蛋白酶Ⅱ消化分离其小肠上皮细胞。培养不同时间后,观察IECs的生长状态,测定细胞生长活性;通过免疫荧光染色和免疫组化对所得IECs进行鉴定,确定最佳的消化酶。对优化所得鸡胚IECs于42℃分别进行2,3,4 h热应激处理,以37℃处理的IECs为对照,MTT法和流式细胞测定IECs的相对活力和凋亡率。【结果】细胞形态学观察发现,用胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合消化分离得到了大量小肠绒毛隐窝团块,易贴壁,细胞生长快;用0.5 g/L胰蛋白酶和中性蛋白酶Ⅱ消化分离得到的细胞数量少,贴壁慢。用3种酶消化方法分离的细胞生长曲线均呈"S"形,但用胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合消化分离的细胞生长曲线峰值较高,细胞活性强;联合消化所得IECs特异性标记抗原均为阳性,免疫荧光阳性率达(92.7±7.9)%,细胞膜质呈棕黄色,而对照组细胞膜质无着色。42℃下热应激3 h后细胞活力极显著下降,凋亡率为(35.96±1.57)%,极显著高于对照组的(0.67±0.02)%,可进行后续试验。【结论】采用胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合消化可得到IECs;42℃下处理3 h是构建IECs热应激模型的条件。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李小芬 詹康 张响英 陶勇 杨晓志 顾文婕
为研究山羊小肠上皮细胞营养吸收调控及其与肠道微生物之间的关系,提供原代细胞培养模型,采用组织块接种来获得山羊小肠上皮细胞,利用有限稀释法来克隆山羊小肠上皮细胞,并通过细胞形态学以及细胞角蛋白18、波形蛋白、肌间线蛋白和细胞生长曲线来鉴定山羊小肠上皮细胞。结果表明:1)采用组织块接种能够分离纯化得到山羊小肠上皮细胞并稳定传至大约10代;2)RT-PCR检测发现山羊小肠上皮细胞不能够表达波形蛋白和肌间线蛋白;3)在正置显微镜下观察到山羊小肠上皮细胞能够产生细胞角蛋白18绿色荧光。研究发现,培养至第8代的山羊小
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
赵倩明 左晓昕 詹康 隋雁南 封飞飞 赵国琦
为研究小肽转运蛋白对小肽转运和吸收机制提供细胞模型,在体外建立原代奶牛小肠上皮细胞分离的方法,采用Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶混合消化液对奶牛小肠组织进行消化,通过2%山梨醇进行密度梯度离心以去除单核细胞、淋巴细胞和肌细胞;用刮除法、相差消化法和96孔板单克隆方法来纯化奶牛小肠上皮细胞,从细胞形态学、细胞角蛋白18免疫荧光染色和小肠上皮细胞特异性标志蛋白来鉴定奶牛肠上皮细胞。结果表明:1)采用Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶联合消化奶牛小肠组织,通过2%山梨醇密度梯度离心可以获得大量的细胞团且48h发生贴壁,但是细胞贴壁
[期刊] 中国农业科学
[作者]
周传丽 刘铮铸 俞英 张勤
【目的】阐明产肠毒素大肠杆菌F18(ETEC F18)引发仔猪腹泻的机理,针对其候选基因FUT1的CDS区第307位点处的突变(G→A),建立3个仔猪小肠黏膜上皮细胞系(GG、GA和AA)。【方法】首先以胎鼠和仔猪为试验材料,确定小肠上皮细胞的最佳分离方法。采用XI型胶原酶和I型中性蛋白酶的联酶混合液,将胎鼠小肠组织机械剪碎后用联酶进行消化和直接将联酶灌注到仔猪小肠腔内消化的两种方法进行比较。针对仔猪小肠黏膜上皮细胞体外培养过程中成纤维细胞污染难以消除的问题,本研究采用局部画圈法逐步去除成纤维细胞。最后,用电镜和CK18免疫荧光染色对纯化后的原代仔猪小肠黏膜上皮细胞进行鉴定。【结果】两种小肠上...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
孙秀梅 程帆 刘维 孙涛 薛秀恒 李培英 王菊花
【目的】比较4种小鼠肠黏膜上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IECs)分离方法的分离效果,建立小鼠IECs的有效分离培养方法,获得小鼠IECs原代细胞,为后续研究做准备。【方法】分别采用组织块培养法、嗜热菌蛋白酶消化法、胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法以及胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ联合消化法共4种方法分离小鼠IECs并培养,通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的IECs进行细胞特异性鉴定,比较4种方法的分离效果。【结果】组织块培养法所获IECs活力好,增殖能力强,但成纤维细胞污染较严重,细胞纯度低;胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ分离法获得的IECs数量少且细胞增殖能...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
姚仕彬 叶元土 蔡春芳 姚林杰 许凡 刘猛 萧培珍 王丽宏
以强化培育后草鱼的肠道粘膜为试验材料,采用不同消化法和离心转速梯度分离肠道粘膜细胞团,分别试验不同培养液与不同CO2浓度组合、胎牛血清浓度及细胞接种浓度时细胞生长效果,并且观察草鱼原代肠道粘膜细胞生长过程,同时采用3种细胞形态观察法、MTT检测法及相关酶活力系统评价细胞培养效果。结果表明:采用机械刮取消化法,分离转速为400 r/min,在使用M199培养液、6%CO2、15%胎牛血清、接种浓度为2×103(个/孔)条件下可批量复制草鱼原代肠道粘膜上皮细胞;细胞增殖过程符合动物原代肠道粘膜上皮细胞生长分化规律,采用荧光倒置显微镜与Giemsa染色法相结合、MTT检测法、AKP酶活力及LDH/M...
关键词：
草鱼 肠道粘膜细胞 分离方法 原代培养
[期刊] 中国农业科学
[作者]
孙裴 张彦明 张浩 高春生 张为民 王晶钰 郭抗抗 党如意
【目的】探索鸡气管上皮细胞(chicken trachea epithelium,CTE)分离培养技术,并研究传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)在CTE中培养特性。【方法】利用气管灌注冷消化法分离培养CTE,对CTE特异性8/18角蛋白作免疫组化鉴定上皮细胞。培养的CTE分别接种IBVM41株和T株,分别在接种后第12～96小时观察接毒细胞形态学变化,应用电镜技术观察CTE细胞病变和病毒粒子结构,利用RT-PCR技术检测CTE中病毒核酸并对CTE中IBV的血凝性和鸡胚致病性进行检测。【结果】利用灌注冷消化法可以获得形态完整并带有纤毛的CTE,细...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
宋增福 吴天星 潘晓东
探讨了健康鲫(Carassius auratus)幼鱼肠道上皮细胞的原代培养方法。结果显示,用含有抗生素、胶原蛋白酶Ⅰ、EDTA和胶原蛋白酶Ⅳ组成的D-Hanks液消化无菌分离的鲫肠道可以获得大量细胞团及绒毛隐窝;用含有抗生素、胎牛血清(FBS)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素的DMEM培养液进行培养,并根据肠道上皮细胞与成纤维细胞贴壁时间的差异进一步纯化,连续培养12d后可以得到纯化的肠道上皮细胞。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
侯海燕 赵立红 乔健 金继昌 赵慧颖 胡永峰
为研究禽流感等敏感病毒及其他致病因子对肺泡上皮Ⅱ型细胞(AEC-Ⅱ)的致病性,建立了鸡AEC-Ⅱ细胞体外培养方法。采用胰蛋白酶和Ⅳ型胶原酶联合消化法对18日龄鸡胚肺组织进行消化,经差速离心和免疫黏附,获得了鸡AEC-Ⅱ细胞,再经纯化、体外培养和碱性磷酸酶染色法鉴定。结果表明,鸡AEC-Ⅱ细胞在接种后18 h开始贴壁进入适应期,细胞为圆形,呈岛屿状生长;接种后24~72 h,进入对数生长期,细胞为多边形,并融合成单层,胞浆内有明显的颗粒;接种后第4天细胞数量达到高峰(1.38×105个/mL),并进入稳定生长期,胞浆内颗粒开始减少;接种后6~7 d,细胞进入衰退期,胞浆内颗粒显著减少,细胞逐渐死...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
韩雅婷 杨学义 徐小明 史明艳 窦忠英
采用酶消化法和组织块法对小鼠、奶山羊、奶牛和家猪的表皮干细胞进行了分离、培养。结果表明:酶消化法适于小鼠表皮干细胞的分离,所获得的小鼠表皮干细胞在维持了两代之后自发分化为神经样细胞;奶山羊和奶牛不论用酶消化法还是组织块法都可以获得大量活力相对较好、表皮干细胞特性维持较久的细胞,奶山羊表皮细胞采用型胶原分选,用有血清培养液培养,经免疫细胞化学鉴定为表皮干细胞,可持续传至少9代,随着代数增高,细胞活力减弱。
关键词：
表皮干细胞 分离 培养 鉴定
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
姜茂成 詹康 严康 赵倩明 赵国琦
在体外分离培养奶牛瘤胃上皮细胞,可为奶牛瘤胃生理功能和吸收机制研究和永生化奶牛瘤胃上皮细胞奠定基础。通过胰蛋白酶消化法从奶牛瘤胃组织中分离出瘤胃上皮细胞,并通过免疫细胞化学的方法检测细胞角蛋白,CCK-8检测细胞生长曲线,β-半乳糖苷酶染色鉴定细胞的衰老以及细胞染色体核型分析来鉴定瘤胃上皮细胞。结果表明:1)利用胰蛋白酶消化法可以稳定的培养出瘤胃上皮细胞并且能够在体外传代大约5代;2)通过在显微镜下进行细胞形态的观察呈单层"岛屿状";3)在荧光显微镜下细胞角蛋白抗原能够发出绿色荧光;4)奶牛瘤胃上皮细胞传
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
冯子建 孙娜 郝志立 孙盼盼 张华 范阔海 尹伟 杨惠珍 钟佳 张振彪 王建中 孙耀贵 李宏全
为建立一种快速分离犬原代乳腺上皮细胞的培养方案，本研究旨在从健康泌乳金毛犬的乳汁中分离原代乳腺上皮细胞，接种于两种不同的培养基后传代培养，探讨不同培养基下细胞的生物学特征，提供犬乳腺上皮细胞简单便捷的分离措施及适宜的培养方法。选取泌乳一周的金毛犬在无菌条件下收集乳汁，离心处理后得到乳腺上皮细胞，分别用完全培养基和基础培养基接种培养，经形态学对比观察，间接免疫荧光检测角蛋白8(Cytokeratin 8)表达情况，绘制两种培养基培养下的第3代乳腺上皮细胞生长曲线；探讨完全培养基培养的第6代乳腺上皮细胞的冻存复苏活力。结果表明：1)乳汁分离可得到大量细胞团块，分别接种两种培养基后都会出现“煎蛋样”贴壁细胞，消化传代后两者均有Cytokeratin 8的高度表达；2)接种于基础培养基的细胞前期以聚集在一起的圆形单克隆细胞团块为主，传至第4代仅有少量细胞存活，细胞随着培养时间增加而状态变差，死亡细胞增多；接种于完全培养基的细胞整体呈“鹅卵石铺路样”成片生长，随着传代次数增加细胞状态稳定，细胞生长曲线呈现“S”形；3)完全培养基培养的第6代乳腺上皮细胞冻存复苏后能快速贴壁并分裂增殖。综上，乳汁分离法成功分离犬乳腺上皮细胞，且与基础培养基相比，完全培养基可以更好地维持细胞活性，促进细胞增殖分裂，且不影响细胞冻存后复苏的活力，为后期快速分离犬乳腺上皮细胞提供较优的培养方案。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王赟 窦忠英 乔海 赵婷 杨春荣
【目的】探寻一种简单的胰腺干细胞的分离方法,以便为糖尿病的细胞治疗研究提供丰富的种子细胞。【方法】采用胰酶消化法分离获得细胞,利用仅含有5%的血清的RPMI1640培养基培养细胞,低浓度的血清使得细胞大量死亡漂浮,只留下少数贴壁的小圆细胞。而后将血清浓度提高到15%以上继续培养;采用免疫组化方法对获得的细胞是否具有胰腺干细胞特征予以检测,并测定了细胞的生长曲线。【结果】在血清浓度提高后每个小圆细胞能快速增殖并形成一个克隆,经过这样增殖后的细胞可以连续传代,目前已传至60代。经免疫组化检测,细胞表达PDX-1、GLUT-2、vimentin等胰腺干细胞的标志;细胞也表达Glucagon、insu...
关键词：
胎猪 胰岛 胰腺干细胞 糖尿病
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
杨倩 练高建 黄国庆 陈杰
实验组肉鸡在灌喂半胱胺 2 0mg·kg-1(CY Ⅰ )和 80mg·kg-1(CY Ⅱ )后 ,应用鸡新城疫弱毒苗 (NDV) (Ⅳ系苗 )以口腔注入法进行免疫 ,检查小肠粘膜中分泌型免疫球蛋白A (sIgA)阳性细胞和上皮内淋巴细胞 (iIEL)数量的变化。结果表明 ,CY Ⅰ在NDV首免后第 4周 ,十二指肠中sIgA阳性细胞数量极显著增加 (P
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