【目的】在紫花苜蓿中表达鸡β-防御素3(Gal-3),为利用紫花苜蓿规模化生产Gal-3奠定基础。【方法】PCR扩增鸡Gal-3基因,以潮霉素作为转基因植物的选择标记,将鸡β-防御素Gal-3基因克隆至表达载体pCAM-BIA1390R(简写为p1390R)上,构建重组表达质粒p1390R-Gal-3;采用冻融法将质粒p1390R-Gal-3转入根瘤农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化至紫花苜蓿;采用PCR检测、Southern blot筛选阳性转基因苜蓿植株,并对Gal-3蛋白进行抑菌活性研究。【结果】PCR扩增获得了240bp的鸡Gal-3基因,成功构建植物表达载体p1390R-Ga...

【目的】克隆和表达鸡β-防御素3(Gal-3)基因,并对其抑菌活性进行研究,为寻找替代抗生素的抗菌肽提供试验依据。【方法】利用RT-PCR方法,从鸡心脏中分离并克隆了鸡Gal-3基因,将其与分子伴侣基因SUMO相融合,再将该融合基因与原核表达载体pET-20b连接后转化至BL21(DE3)宿主细胞中,经IPTG诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析;最后,对Gal-3融合蛋白进行纯化,并对表达产物进行体外抑菌试验。【结果】通过RT-PCR扩增获得了约240bp的鸡Gal-3基因,经IPTG诱导获得约26ku的蛋白。IPTG在终浓度为0.6mmol/L,33℃诱导4...

叶黄素循环是植物应对环境胁迫进行热耗散的光保护途径之一，紫黄质脱环氧化酶基因(VDE)是叶黄素循环脱环氧化过程的关键基因。本研究采用RACE技术首次克隆了云南逸散紫花苜蓿(Medicago sativa)的MsVDE基因，同时采用实时荧光定量分析干热胁迫下的MsVDE基因表达特征。结果表明，MsVDE全长1 678 bp,CDS编码区1 608 bp，编码535个氨基酸。氨基酸序列保守区域具有3个VDE基因的特征区，即N-端半胱氨酸富集区、脂质运载蛋白特征区和C-端谷氨酸富集区。进化树分析表明该基因与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula) VDE基因的氨基酸序列亲缘关系最近。干热胁迫第4天和第8天时的MsVDE基因表达量分别比正常条件上调了2.13倍和1.97倍；喷洒二硫苏糖醇(1, 4-Dithiothreitol, DTT)溶液后MsVDE基因表达量平均下调了55%。本研究初步得出，云南逸散紫花苜蓿MsVDE基因在调控叶黄素循环应对干热胁迫中起作用。

碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子是真核生物转录因子中分布最广泛、最保守的一类蛋白。目前在许多植物中已发现大量的bZIP转录因子,这些bZIP转录因子成员广泛参与种子贮藏基因的表达、植物的生长发育、光信号传导、病害防御、生物和非生物胁迫应答以及ABA的敏感性等各种信号的反应。本研究首次从紫花苜蓿(Medicago sativa)全转录组水平鉴定出bZIP转录因子家族共包含138个基因,根据bZIP蛋白序列进行系统进化分析可以将其分为10类;对MsbZIP基因的系统进化分析表明该基因家族在分类上有很高的保守

紫花苜蓿(Medicago sativa)是世界上种植面积最大、应用最广泛的豆科牧草。由于其耐盐性中等,其在我国北方地区的产量和种植受到土壤盐渍化的限制。因此提高紫花苜蓿的耐盐性具有重要的科学和生产意义。为此,以龙牧801紫花苜蓿(M.sativa‘Longmu 801’)为试验材料,采用实时荧光定量PCR技术分析了不同浓度NaCl胁迫下9个盐胁迫蛋白质组筛选出的盐响应相关基因的表达模式。结果显示,处理时间和处理浓度对9个基因的相对表达量均有显著性影响,表明这9个基因均在紫花苜蓿盐胁迫应答中发挥着一定作用。处理1h时,G6PI、ABP19a、Trx-h1、PR bet 1、FBPA、6PGDH和ALDH这7个基因的相对表达量在不同NaCl胁迫浓度处理的紫花苜蓿中均显著上调,RRM和GDPD在NaCl处理2h后开始上调。除G6PI基因,其他8个基因在0.4%NaCl处理下相对表达量显著高于0.2%和0.8%NaCl处理。这些基因参与糖代谢、信号转导和胁迫响应。以上结果表明,紫花苜蓿的耐盐性极其复杂,涉及到多基因的表达和代谢通路的调控。研究结果有助于全面研究并了解紫花苜蓿的盐响应相关基因的表达模式,促进紫花苜蓿耐盐分子育种。

甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）介导甘油脂质生物合成的起始步骤，在植物生长发育过程中起着关键作用。本研究以紫花苜蓿（Medicago sativa）栽培品种‘中苜1号’为材料，采用RT-PCR技术克隆了MsGPAT11基因。通过生物信息学分析表明，紫花苜蓿MsGPAT11基因CDS全长为1 497 bp，编码498个氨基酸；蛋白质分子质量55.55 kDa，等电点为9.27；含有保守的酰基转移酶结构域，是典型的GPAT家族基因；系统进化树分析表明MsGPAT11蛋白与同属植物蒺藜苜蓿GPAT蛋白亲缘关系最近，且与拟南芥AtGPAT6归于同一亚家族。时空表达分析表明MsGPAT11具有明显的组织特异性，在花中具有极高的表达量。非生物胁迫表达分析表明MsGPAT11基因明显受到干旱胁迫（PEG6 000）、高盐胁迫（NaCl）、冷胁迫（4 ℃）的诱导；且在盐、旱胁迫9 h后，MsGPAT11基因表达量显著上升并出现峰值。推测该基因可能参与了紫花苜蓿旱、盐的非生物胁迫调控过程并发挥重要作用。综上所述，本研究可为今后进一步探讨MsGPAT11基因在逆境下的生物学功能提供理论参考。

【目的】DELLA蛋白属于GRAS家族,是赤霉素信号转导途径中重要的转录因子,负向调节GA转导途径。克隆获得紫花苜蓿GAI,分析其基因生物信息学特征并预测蛋白结构域。明确紫花苜蓿GAI组织表达特征及不同处理下的表达模式,构建该基因超表达载体并转入紫花苜蓿,以探究DELLA蛋白基因在紫花苜蓿赤霉素(GA)信号转导途径及胁迫条件下的作用机理。【方法】利用同源克隆的方法,从紫花苜蓿中克隆得到MsGAI。利用生物信息学方法分析该基因的序列特征,使用MEGA7.0对MsGAI蛋白序列及同源序列进行多序列比对,构建同源物种间的系统发育树。利用实时荧光定量PCR检测紫花苜蓿各组织GAI表达量以及在PEG、NaCl、GA、ABA和黑暗处理下,GAI的表达变化。同时对转基因GAI株系表达水平进行分析,选择表达量高、中、低株系(L5、L8、L11)分别进行PEG和NaCl处理,分析GAI的表达变化。以pBI121为基础载体,采用双酶切-连接的方法构建植物超表达载体35S:MsGAI-gus。将重组载体转入农杆菌GV3101菌株中,以紫花苜蓿叶片为外植体,采用农杆菌介导的愈伤组织转化法转化紫花苜蓿,经PCR检测和GUS组织化学染色,得到转基因阳性苗。【结果】该基因序列包含有一个1 818 bp的开放阅读框,编码605个氨基酸。生物信息学分析结果显示,MsGAI蛋白具有GRAS家族的典型结构域和保守区,其中包含N端保守结构域DELLA和TVHYNP,C端保守结构域SAW。多序列比对及系统进化树分析表明,该序列与其他物种的DELLA蛋白序列相似度均高达80%以上,将其命名为MsGAI。该基因与蒺藜苜蓿GAI亲缘关系最近,其次与鹰嘴豆、红三叶等双子叶豆科植物亲缘关系较近,与大麦等单子叶植物较远。实时荧光定量PCR分析表明,MsGAI在紫花苜蓿各组织中均有表达,根中的表达量最高。经PEG、NaCl、GA以及ABA处理后,均有明显响应;黑暗处理显著抑制MsGAI的表达。转基因株系经PEG、NaCl处理后,GAI表达量均上调。对构建完善的35S:MsGAI-gus植物超表达载体进行双酶切检测,琼脂糖凝胶电泳显示,条带大小与预期一致。对转基因植株进行GUS组织染色验证,结果表明,阳性植株呈现蓝色,对照组为白色。对超表达载体携带的MsGAI和GUS序列进行PCR检测均呈阳性。【结论】紫花苜蓿DELLA蛋白基因的克隆和超表达载体构建成功,MsGAI对逆境胁迫有响应。

[目的]分析紫花苜蓿MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C的表达差异并研究其抗旱功能,为苜蓿抗旱机制解析及分子育种奠定基础。[方法]采用qPCR的方法,分析紫花苜蓿MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因在20%PEG6000溶液模拟干旱条件下表达的差异,采用农杆菌介导法获得MsRCI2A、MsRCI2B和MsRCI2C基因超量表达的转基因苜蓿A12、A22、B13、B19、C2和C10,观察正常生长条件(干旱胁迫0 d)下和20%PEG6000干旱胁迫6,12 d的野生型株系WT(对照)及超量表达的转基因紫花苜蓿的表型,测定超表达苜蓿和WT的叶绿素含量、相对电导率、丙二醛(MDA)含量、抗氧化酶(超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT))活性及渗透调节系统(可溶性糖和脯氨酸含量)在干旱胁迫条件下的变化。[结果]在20%PEG6000模拟干旱条件下,MsRCI2A/B/C基因在紫花苜蓿叶和根中表达变化趋势相反,但3个基因在同一组织中的表达趋势相似。紫花苜蓿叶片中的MsRCI2A/B/C基因在干旱胁迫处理后均明显上调,其中MsRCI2A/C基因在干旱胁迫处理2 h时即极显著上升(P<0.01),为WT的3.00～3.46倍,而相对电导率和丙二醛含量则极显著下降了73%和55%。转基因苜蓿叶和根中的可溶性糖和脯氨酸含量及SOD、POD和CAT活性均显著升高(P

为明确成团泛菌CQ10脂多糖(Pantoea agglomerans CQ10 Lipopolysaccharide,CQ10-LPSp)对紫花苜蓿(Medicago sativa)幼苗抗氧化酶和防御酶的作用，以紫花苜蓿‘巨能551’种子(种子表面消毒组和未消毒组)为试验材料，采用低浓度(0、0.067和0.134 EU·mL~(-1))和高浓度(0.200和0.267 EU·mL~(-1))的CQ10-LPSp与紫花苜蓿互作，研究CQ10-LPSp对紫花苜蓿幼苗的抗氧化特性[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)]和防御酶活性[苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和脂氧合酶(LOX)]的影响。结果表明：随着CQ10-LPSp浓度的升高，未消毒组和消毒组苜蓿幼苗的SOD、POD和PPO、PAL活性均呈先升后降趋势，在0.200 EU·mL~(-1)时达到最大值；MDA含量随着CQ10-LPSp浓度的升高呈先降后升再降的趋势，且均显著低于对照，而CAT活性却持续下降。低浓度CQ10-LPSp处理下，未消毒组幼苗CAT、MDA,PAL和LOX活性都大于消毒组，而POD、SOD和PPO却低于消毒组；高浓度CQ10-LPSp处理下，未消毒组幼苗CAT和MDA小于消毒组，POD、SOD和PAL高于消毒组。综上所述，紫花苜蓿幼苗对CQ10-LPSp的耐受能力存在浓度阈值效应，其耐受能力随着CQ10-LPSp浓度的升高而减弱，耐受阈值为0.200EU·mL~(-1)；低浓度CQ10-LPSp处理下，未消毒组苜蓿幼苗的抗氧化酶和防御酶活性高于消毒组。研究结果可为脂多糖的开发及诱导紫花苜蓿的先天免疫作用研究提供科学依据。

研究证明,转录因子广泛参与植物的生长发育过程并响应多种生物/非生物胁迫信号途径。低温胁迫可导致紫花苜蓿(Medicao sativa)减产、越冬率降低以及生产年限缩短。利用新一代高通量转录组测序技术,本研究对4℃低温胁迫下紫花苜蓿中响应低温胁迫的转录因子基因进行了鉴定,并对其表达情况进行分析,结果表明,转录组测序共获得78 925条Unigene序列和3 448个差异表达基因。其中,从3 448个差异表达基因中共鉴定出43个转录因子家族,共251个基因被显著地诱导表达。不同转录因子家族基因受低温胁迫诱导表

为获得抗旱性较强的转基因苜蓿植株,以紫花苜蓿品种中苜2号作为基因转化受体,通过对外植体选择、菌液浓度、选择压确定、侵染时间和共培养时间等因素进行优化,成功建立了农杆菌介导的遗传转化体系。在此基础上,将沙冬青脱水素基因通过农杆菌的介导,转化到中苜2号中。试验结果显示,子叶和下胚轴作为外植体愈伤组织诱导频率最高,可达100%;获得抗性愈伤组织与转基因植株的卡那霉素最佳筛选浓度为25 mg/L;外植体与农杆菌的共培养时间以5 d为最佳。试验共获得126株T0抗性株,PCR检测30株表现为阳性,表明脱水素基因已转入受体植株中。

为了提高ＭＤＣＫ细胞表面禽流感病毒（ＡＩＶ）受体的水平，以１２日龄的ＳＰＦ鸡胚为试材，通过反转录ＰＣＲ扩增唾液酸转移酶Ⅰ基因（Ｓｔ３ｇＡｌⅠ），并将回收的片段插入到ＰＭＤ１８－ｔ载体中。酶切ＰＭＤ１８－ｔ－Ｓｔ３ｇＡｌⅠ和ＰＣＩ－ｎｅｏ质粒，将目的片段进行连接，构建含有Ｓｔ３ｇＡｌⅠ基因的真核表达载体。利用脂质体介导法转染ＭＤＣＫ细胞，在ｇ４１８的筛选下，获得具有抗性的转基因细胞系。通过细胞克隆化培养和ＰＣＲ检测，筛选可稳定表达Ｓｔ３ｇＡｌⅠ基因的细胞株。结果表明，从鸡胚中克隆的Ｓｔ３ｇＡｌⅠ基因成功的插入到ＰＣＩ－ｎｅｏ质粒，从而实现真核表达载体ＰＣＩ－ｎｅｏ－Ｓｔ３ｇＡｌⅠ的构建。在ｇ４１．．．

【目的】酸铝胁迫是南方农业生产面临的主要环境胁迫之一。研究乡土植物对酸铝胁迫的适应机理,发掘并利用优良基因培育抗酸耐铝作物新品种,从而为紫花苜蓿分子遗传改良奠定基础。【方法】贵州省草业研究所紫花苜蓿遗传改良组前期已从贵州乡土资源平坝苦油菜中克隆获得BjMATE,并将其构建过量表达载体。采用组织培养和花器官浸泡法分别对紫花苜蓿和拟南芥进行遗传转化,根据NPT抗性基因和特异基因设计引物对转化材料进行分子鉴定,并采用qRT-PCR进行表达量的鉴定。利用水培法平行比较转基因和对照紫花苜蓿在酸、铝和酸铝组合胁迫条件下的发芽率、幼苗生长状况,以及在长时间弱酸铝胁迫条件下的幼苗地上和地下部分的生长变化。采用酶标仪检测酸、铝以及酸铝组合胁迫条件下转基因和对照紫花苜蓿根系中POD、SOD、CAT等抗氧化酶的活性和MDA含量的变化,同时在BjMATE过表达的拟南芥中采用qRT-PCR的方法分析酸铝代谢途径的关键基因AtMATE、AtPIN2、AtALS3、AtALMT1和AtSTOP1在胁迫条件下的表达变化,并对其调控关系进行讨论。【结果】过量表达BjMATE的拟南芥和紫花苜蓿的阳性率分别为100%与66.7%,候选紫花苜蓿和拟南芥转基因株系中BjMATE的表达量分别比对照上调63.02和76.87倍。过量表达BjMATE紫花苜蓿株系OEMs-5和对照中苜1号紫花苜蓿的发芽率在正常、酸胁迫、铝胁迫和酸铝组合胁迫条件下都没有显著差别,但是其发芽势在胁迫条件下显著优于对照中苜1号。在长时间弱胁迫条件下,OEMs-5的株高与对照没有显著区别,但在铝离子胁迫和酸铝组合胁迫条件下,其的生物产量和根系伸长显著优于对照中苜1号。抗氧化酶活性和MDA含量在OEMs-5与中苜1号中的变化不尽相同。POD和SOD的活性在胁迫处理后的2个材料中都显著上升,但只有SOD的活性在2材料间差异显著。CAT的活性在处理间和材料间都没有显著的差异。MDA的含量略有下降,在铝离子和酸铝组合胁迫条件下的2个材料中差异达显著水平。qRT-PCR显示,在OEAt-1植株中,AtMATE、AtPIN2、AtALS3、AtALMT1和AtSTOP1受铝和酸铝组合胁迫诱导,但只有AtSTOP1在OEAt-1与野生型之间差异显著。【结论】BjMATE能够正向调节紫花苜蓿在种子萌发和幼苗生长阶段对酸铝胁迫的耐受性。活性氧清除系统尤其是SOD以及酸铝代谢途径关键基因AtSTOP1可能参与BjMATE介导的酸铝胁迫调节。

【目的】从鹅的组织中克隆鹅β-防御素10(avianβ-defensin 10,AvBD10)基因,通过大肠杆菌进行原核表达,检测重组鹅AvBD10蛋白的生物学特性。【方法】采用RT-PCR方法,从鹅的肾脏组织中扩增鹅AvBD10基因。根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素的氨基酸序列构建系统进化树,进行遗传进化分析;并应用荧光定量的方法对该基因的组织表达水平进行鉴定。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上进行原核表达,并对该重组蛋白进行纯化,测定体外生物学活性。【结果】从鹅肾脏组织中克隆出了鹅AvBD10基因,该基因的cDNA大小为207 bp,编码68个氨基酸。经遗传进...

褶纹冠蚌(Cristaria plicata)样本壳长(9.50±1.05)cm、壳高(6.45±0.81)cm,暂养1周。40只随机分成试验组和对照组,每组20只。用Trizol法提取经诱导刺激后0、6、12、24、36、48 h的血液、外套膜、鳃、肝胰腺组织RNA,构建褶纹冠蚌cDNA文库并从中获得防御素基因cDNA全长序列。结果表明,褶纹冠蚌防御素序列全长为514 bp,其中5’UTR有57 bp;3’UTR有242 bp,含有一个poly(A)尾;开放阅读框长度为192 bp,编码63个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白N端为1个由23个氨基酸构成的信号肽,成熟肽由40个氨基酸组成,理论等电点...