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[期刊] 华北农学报
[作者]
陈红英 宋凌云 崔保安 胡功政 贾艳艳 郭显坡
通过PCR技术从罗曼鸡肝脏基因组中扩增鸡α干扰素(ChIFN-α)全基因,并克隆和测序。序列分析表明,ChIFN-α基因全长为582 bp,亚克隆其成熟蛋白编码基因489 bp,利用基因重组技术构建了重组质粒,使ChIFN-α置于原核表达载体pQE30的T5启动子下并同6×His(多聚组氨酸标签)-Tag融合。经酶切和PCR鉴定,DNA测序证实重组质粒pQEChIFN-α构建正确;将pQEChIFN-α转化大肠杆菌M15感受态细胞,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Westernblot证实表达出分子质量为19.80 kDa的融合蛋白。表达的蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性处理后,在Ve...
关键词：
鸡 α干扰素 克隆 原核表达 抗病毒活性
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
曹瑞兵 周斌 陈德胜 陈溥言
提取经ConA诱导培养的猪外周血白细胞总RNA ,RT -PCR扩增出猪IFN -γ基因并克隆到pGEM -T -easy载体 ,测序结果表明扩增片段是含有信号肽的猪IFN -γ的完整基因。设计 1对引物亚克隆猪IFN -γ成熟蛋白基因并对其5′端前 2个稀有密码子进行大肠杆菌偏嗜性改造。经测序鉴定后插入原核表达载体pRLC ,并实现在大肠杆菌中的高效表达。表达产物以包涵体形式存在 ,经 7mol·L-1盐酸胍的变性液溶解及 0 5mol·L-1盐酸胍复性液复性处理 ,表达产物进行脱盐、凝胶层析纯化。细胞病变抑制法测定结果表明 ,重组猪IFN -γ具有较高的干扰素活性 ,约为 4 5× 1...
关键词：
猪γ干扰素 基因改造 原核表达 分离纯化
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王彦彬 崔保安 陈红英 王亚宾 张红英 魏战勇
【目的】为获得重组猪干扰素α。【方法】本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟猪干扰素α基因插入供体质粒pFastBacⅠ多克隆位点,置于pH启动子控制下,昆虫可识别的蜂素信号肽(honeybeemelittinsignalpeptide,HBM)取代猪干扰素α原有信号肽以实现分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10感受态细胞进行同源重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。【结果】重组蛋白通过间接免疫荧光、Western-blot证明重组蛋白在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
曹瑞兵 王艳 魏建超 陈溥言
亚克隆犬α1干扰素(CaIFN-α1)成熟蛋白编码基因并克隆到表达载体pPICZα-A,构建转移重组载体pPICZα-A-CaIFN-α。pPICZα-A-CaIFN-α经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。转化子经PCR分析鉴定后利用甘油增菌和甲醇诱导,实现了CaIFN-α1在毕赤酵母系统中的分泌表达。SDS-PAGE检测结果表明表达产物相对分子质量约为2.7×104,比其推导结果(约1.9×104)大,推测可能是发生了糖基化。酵母分泌表达的CaIFN-α1具有较高的抗病毒活性,约为1.45×106U·mL-1,蛋白含量约为96mg·L-1,比活性为1.49×107U·mg-...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
崔保安 陈红英 张素梅 刘占通 金喜新 宋凌云
【目的】利用基因工程技术寻求能够高效、稳定表达猪α干扰素,且表达产物易于纯化的表达系统。【方法】以含猪α干扰素(IFN-α)基因的重组质粒pGEM-T-IFN-α为模板,PCR扩增猪α干扰素基因。将IFN-α片段定向插入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-IFN-α,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白(GST-IFN-α)。【结果】SDS-PAGE可检测到相对分子质量约为45 ku的GST-IFN-α,Westernblot证实GST-IFN-α能与猪IFN-α单克隆抗体发生特异性反应。重组猪α干扰素经谷胱苷肽Sepharose-4B亲...
关键词：
猪α干扰素 原核表达 抗病毒活性
[期刊] 华北农学报
[作者]
符芳 姜北宇 张莉 高轩 张飚
参照NDVLa Sota株核酸序列(AF077761)设计1对引物,利用RT-PCR扩增F基因并得到了长为1 700 bp的片段,将其克隆到pGEM-T easy vector中,经酶切鉴定和测序后克隆进原核表达载体pET-32a,将重组表达质粒转化BL21(DE3),在IPTG诱导下表达约83 kd的融合蛋白,SDS-PAGE电泳和Western blotting检测证实该基因片段获得高效表达且表达产物具有免疫学活性。
关键词：
新城疫病毒 F基因 克隆 原核表达
[期刊] 中国水产科学
[作者]
尹经逵 史燕 朱新平
对斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)的干扰素调节因子(1Interferon regulatory factor1,IRF-1)基因进行了克隆、测序及原核表达。以PBS做对照,利用polyI:C刺激斜带石斑鱼,然后取其肝脏、头肾、脾脏提取总RNA,随机引物反转录获得cDNA。根据相近物种IRF-1的保守序列设计引物,通过PCR得到了保守片段,通过RACE-PCR获得了斜带石斑鱼IRF-1基因的全长cDNA。基因全长为1730bp,完整开放阅读框(ORF)906bp,编码302个氨基酸,5′非编码区153bp,3′非编码区671bp。将斜带石斑鱼ORF与其他物种进行比对发现,...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
刘莉 刘鹏 金佳丽 吴海丽 王改改 江晨 采克俊
Mx蛋白是一类由I型干扰素(IFN)诱导表达的抗病毒蛋白。以PolyI∶C诱导的草鱼(Ctenopharyngodon indellus)肾细胞(CIK cells)为材料,抽提细胞总RNA,通过RT-PCR的方法扩增出Mx基因cDNA全序列,连接至pMD20-T载体上,构建重组质粒pMD20-T-Mx,并测序进行序列分析。用限制性内切酶从克隆的重组质粒pMD20-T-Mx上切下Mx基因,插入到质粒pEGFP-C1中,构建真核表达载体pEGFP-C1-Mx。结果显示,该基因cDNA全序列为1 921 bp,阅读框共编码627个氨基酸,分子量约为71.1 ku,理论等电点pI为8.33,其编码的...
关键词：
草鱼 Mx基因 克隆 序列分析 载体构建
[期刊] 华北农学报
[作者]
李彬 毛立 何孔旺 温立斌 茅爱华 张雪寒 倪艳秀 郭容利 马俊杰 周俊明 吕立新 俞正玉
猪博卡病毒是近年来新发现的一种细小病毒。本研究根据其部分基因组序列(GenBank登录号GU902967-GU902971)设计了一对引物,采用PCR方法扩增出了猪博卡病毒的NP1基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了重组质粒pET32a-NP1,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3)中,并进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌可表达分子量为46 kDa的融合蛋白,蛋白表达量较高,而且蛋白以可溶性形式存在于菌体中。表达产物经纯化后,目的蛋白纯度较好。Western Blot结果显示,表达的NP1蛋白能与His抗体发生特异性的免疫反应,表明原核表达的NP1蛋白具有良...
关键词：
猪博卡病毒 NP1基因 克隆 原核表达
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
张立娜 刘培欣 曹殿军 闫丽辉 贾竞波 危艳武
以含有全长猪γ干扰素基因的质粒为模板,通过PCR方法扩增猪γ干扰素并引入酶切位点,酶切后与PCI真核表达载体连接在一起,测序后经比较,所扩增序列同Genebank报道的IFN-γ序列同源性为99·8%.将重组质粒转染PK细胞,检测所转染的pIFN-γ的抗病毒活性.试验结果表明,转染pIFN-γ试验组与正常细胞接毒对照组比较有显著差异,说明所构建的重组质粒转染后具有抗病毒作用.
关键词：
猪γ干扰素 真核表达 活性测定
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
周勇 范玉顶 黄莉莉 曾宪辉 张雪萍 张琳琳 曾令兵
【目的】开展青鱼γ－干扰素（ＩＦＮ－γ）基因的克隆、结构特征与表达谱分析研究。【方法】采用ｃＤＮＡ末端快速扩增技术获得了青鱼（ＭｙｌｏｐｈＡｒｙＮｇｏＤｏＮ ｐＩｃｅｕｓ）ＩＦＮ－γ基因ｃＤＮＡ的５′和３′末端序列，然后根据其末端序列设计特异性引物，扩增得到青鱼ＩＦＮ－γ基因ｃＤＮＡ全长序列，对其序列和编码氨基酸序列进行生物信息学、同源性比较及系统进化树分析，同时对其在青鱼各组织中的表达进行分析。通过构建真核表达载体，将其转染青鱼鳍条组织细胞进行表达分析。【结果】青鱼ＩＦＮ－γｃＤＮＡ全长为８９５ｂｐ，其开放阅读框大小为５４９ｂｐ，编码１８２个氨基酸。氨基酸序列比对分析结果显示，青鱼ＩＦＮ－γ．．．
关键词：
青鱼 IFN-γ基因 结构特征 表达分析
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
刘宝山 赵玉军 张交儿
根据GeneBank上的猫IFN-β基因序列,设计了1对特异性引物,对猫肝组织中提取的DNA进行PCR扩增,然后将扩增产物插入pUCm-T克隆载体进行了克隆。测序分析表明,克隆的IFN-β基因序列与GeneBank中的基因(NM_001009297)存在一个碱基差异,第446位碱基由T变为C,二者同源性高达99.82%,同时这个碱基的差异没有引起氨基酸的改变。将其双酶切后插入原核表达载体pGEX-KG,构建成功重组表达载体pGEX-IFNB,将其转化BL21(DE3)后成功进行了诱导表达。SDS-PAGE和Western-Blot分析表明,在35KDa处出现蛋白表达条带,表达量占菌体蛋白的12...
关键词：
β干扰素 猫 克隆 表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王俊全 王韦华 刘桂梅
【目的】克隆鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)BJ-10株VP2基因,构建其原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行高效表达。【方法】根据IBDVVP2基因序列设计1对特异性引物,应用RT-PCR技术克隆IBDV BJ-10株VP2基因;将目的基因插入pMD18-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET-32α中,转化入JM109,经IPTG诱导表达,对产物进行SDS-PAGE电泳分析,确定IPTG的最佳诱导表达时间和浓度。【结果】克隆到了全长1 356bp的IBDV BJ-10株VP2基因;PCR、酶切鉴定分析表明,成功构建了重组质粒pET-32α-VP2;SDS-PAGE电...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
李友娟 郭凤达 葛均青 林天龙
将鳗鲡疱疹病毒(AngHV)福建株(AngHV-FJ)ORF51基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,构建表达质粒pGEX-4T-2-ORF51,将其转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导后,收集表达菌体,进行SDS-PAGE分析和免疫印迹试验验证,结果表明,获得了高效表达的AngHV-FJ ORF51融合蛋白.经割胶回收纯化,获得高纯度的融合表达蛋白.用纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的兔抗ORF51多克隆抗体.这为进一步研究ORF51蛋白的结构和功能及开展AngHV病的防治研究提供了重要的研究基础.
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
程晓盈 张彦明 王(韦华) 邢福珊 郭抗抗 洪海霞
利用RT-PCR技术扩增出不含信号肽的猪瘟病毒石门株的E2基因,将其克隆到PGEX-T-Easy 载体上,用BamH Ⅰ和HindⅢ进行双酶切,回收目的基因。将目的基因克隆到表达载体质粒pPROEX-HTb中,获得 重组质粒PPRO,EXE2,用pPROEXE2转化大肠杆菌,诱导含重组质粒PPROEXE2的大肠杆菌BL21表达E2基因蛋 白,研究E2蛋白与猪瘟阳性血清反应的特异性。结果表明,受体菌诱导后能表达E2基因蛋白,所表达的E2蛋白能 与猪瘟阳性血清发生特异性很强的反应。
关键词：
猪瘟病毒石门株 E2基因 克隆 表达
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