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[期刊] 中国农业科学
[作者]
闫若潜 谢彩华 吴志明 张志凌 刘光辉 刘梅芬
【目的】研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂以对鸡的病毒性疾病进行防治。【方法】采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头将鸡α干扰素(chicken interferon alpha,ChIFN-α)与鸡白细胞介素2(chicken interleukin-2,ChIL-2)基因构建成ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因并克隆入pGEM-T Easy载体,将嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体中进行原核表达。通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rCh...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
陈吉刚 陈维虎 周继勇 王金勇 齐静 郑肖娟 俞照正 孙红霞
将去除信号肽的鸡IL-2基因编码框克隆到原核表达载体pBAD/HisB,实现了重组鸡IL-2(rchIL-2)蛋白在大肠杆菌中的高效表达。SDS-PAGE分析显示,表达蛋白的分子量约为18kD。用rchIL-2为抗原制备了单克隆抗体和多克隆抗体,建立了检测rchIL-2含量的抗原捕获ELISA,探讨了天然chIL-2蛋白的体外表达动力学。非变性条件下纯化的rchIL-2(0.4ng)对ConA活化的鸡T淋巴细胞具有明显的增殖活性,而对鸭及鹅的T淋巴细胞无增殖活性。抗chIL-2多克隆抗体可完全中和rchIL-2和天然chIL-2蛋白的生物学活性,而单克隆抗体无中和rchIL-2和天然chIL-...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王彦彬 卢中华 康相涛 宋素芳 孙桂荣 韩瑞丽 李国喜 李守义
参照GenBank上已发表的鸡白细胞介素2序列设计引物,运用RT-PCR技术,从经ConA诱导的 20～35日龄固始鸡脾细胞总RNA中扩增出目的片段,IL-2基因,将其插入到pGEM-T载体上,构建了克隆质粒 pGEM-T-chIL-2。测序结果表明,本试验克隆的固始鸡白细胞介素2基因与GenBank上已发表的序列相比,存在2 个核苷酸变异。重新设计表达引物,以克隆质粒pGEM-T—chIL一2为模板PCR扩增表达片段,对表达片段进行 Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切,连接到作同样双酶切的pET28a表达载体上,鉴定后转化大肠杆菌BL21并进行IPTG 诱导表达,然后对表达产物进行SDS-PA...
关键词：
固始鸡 白细胞介素2 原核表达 生物活性
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘钦松 张丛丛 刘孟刚 许彤
构建人源白介素(h-IL2)基因的表达载体,并尝试在原核细胞中诱导表达,以用于进一步重组蛋白纯化和抗体生产。以h-IL2基因为模板,采用PCR技术扩增h-IL2基因,连接到pMD-18T载体中构建克隆载体,转化到感受态DH5α,提取质粒PCR、双酶切验证连接成功,经DNA测序鉴定基因序列与GenBank数据库收录h-IL2基因(NM_000586.3)序列一致;再将h-IL2基因插入到pGEX-4T-1构建表达载体,转化至感受态BL21(DE3),筛选阳性克隆IPTG诱导。SDS-PAGE验证成功表达融合蛋白GST-IL2。
关键词：
白细胞介素 基因克隆 原核表达
[期刊] 中国水产科学
[作者]
邱丽华 冯娟 江世贵 张汉华 宋林生
采用同源克隆和锚定PCR技术,从军曹鱼(RachycentroncanadiumLinnaeus)中克隆到白细胞介素1β(interleukin 1β)基因cDNA的全序列。军曹鱼IL 1β的cDNA全长1104bp,3′非编码区域(UTR)为255bp,5′UTR为108bp,开放阅读框(ORF)为741bp,编码246个氨基酸,分子量大约为27 68kD,理论等电点为5 71。同源性分析表明,该序列与其他鱼类甚至哺乳动物的IL 1β基因具有很高的相似性,并含有白细胞介素家族的签名序列(signature)。同时,利用RT PCR技术,对特异性病原刺激下该基因在鱼体内的表达情况进行初步研究,...
[期刊] 华北农学报
[作者]
陈红英 黄青云 崔保安 李新生 管倩 刘金朋
为构建表达鸡IL-18的重组禽痘病毒,将含痘病毒启动子LP2EP2驱动的鸡IL-18基因插入到禽痘病毒转移载体pSY681中,获得重组转移载体pSY681/ChIL-18。将pSY681/ChIL-18转染已感染亲本禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,使其在鸡胚成纤维细胞内与禽痘病毒基因组发生同源重组,产生表达鸡IL-18的重组禽痘病毒rFPV-ChIL-18。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选后,对重组病毒rFPV-ChIL-18又进行了多次蚀斑克隆。以重组禽痘病毒DNA为模板,利用鸡IL-18基因特异引物进行PCR,扩增出1条约0.6 kb的带。收集含鸡IL-18蛋白...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
郑鸣 边传周 王老七 王永芬
【目的】研制高效的猪基因工程干扰素制剂用于猪病毒性和肿瘤性疾病的防治。【方法】采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)技术将PoIFN-α、PoIFN-β和PoIFN-γ成熟肽基因进行连接,形成3种融合基因PoIFN-α/β、PoIFN-α/γ和PoIFN-β/γ,并构建到原核表达载体pET30a进行融合表达,用细胞病变抑制试验和淋巴细胞转化试验测定融合蛋白rPoIFN-α/β、rPoIFN-α/γ和rPoIFN-β/γ的生物学活性,同时与非融合干扰素rPoIFN-α、rPoIFN-β和rPoIFN-γ进行比较分析。【结果】成功构...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
王资生 齐志涛 黄贝 张启焕 仇明 邵荣
根据梭鱼IL-22cDNA序列设计特异性引物,从梭鱼脾脏中扩增IL-22用于表达片段,连接至载体pUC57。分别以BamHⅠ和KpnⅠ对含有目的基因的质粒和pQE-30进行酶切,连接并转化到大肠杆菌M15中,以IPTG进行诱导表达。表达产物通过Ni-NTA亲和层析进行纯化。经SDS-PAGE对表达产物进行鉴定。SDS-PAGE显示该IL-22表达质粒经IPTG诱导后,IL-22重组蛋白主要在菌体培养上清中表达。通过优化蛋白表达及纯化方法,成功获得了梭鱼IL-22活性蛋白。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李祥瑞 金红 卢景良
用哺乳动物细胞表达克隆系统克隆了鸡ＩＬ－２ｃＤＮＡ。以ＣｏｎＡ（２０μｇ／ｍＬ）诱导ＳＰＦ鸡脾脏淋巴细胞，第２０小时收集细胞，提取ｍＲＮＡ，以ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＰｌａｓｍｉｄＳｙｓｔｅｍｆｏｒｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ试剂盒合成ｃＤＮＡ，定向连结于穿梭质粒ｐＳＶ·ＳｐｏｒｔⅠ，构建ｃＤＮＡ文库。将文库分组提取重组质粒，转染ＣＯＳ－７细胞，表达ｃＤＮＡｓ。以淋巴细胞增殖试验检测表达产物ＩＬ－２活性。经过３轮筛选，获得１４个具有ＩＬ－２活性的克隆。选择其中４个进行酶切分析，结果显示这４个ｃＤＮＡ大小分别为１．５，１．０，０．８和０．８ｋｂ。
关键词：
鸡 白细胞介素-2 cDNA 克隆
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
赵雅坤 史贤明 张忠明
人白细胞介素4(hIL4)是一种重要的免疫活性调节分子,与一些自身免疫性疾病有重要关系。将hIL4基因融合到衣藻叶绿体rbcL 5-’UTR和3’-UTR之间,组成5’UTR-hIL4-3’UTR片段,将其插入到来源于衣藻叶绿体基因组5.7 kb同源片段中,构建成pXhIL4同源重组质粒。利用电脉冲法将该质粒与含有aadA基因的壮观霉素抗性质粒p228共同转化衣藻叶绿体,从含100μg/mL的壮观霉素抗性平皿上筛选到阳性藻落,并通过PCR方法检测到hIL4基因,其共转化频率高达90%。经过western blotting印迹转移分析,证实了人白细胞介素4基因在衣藻叶绿体中获得成功表达,为进一步...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘文强 赵宏坤
【目的】为了阐明重组蛋白的活性,置备具有生物学活性的重组白细胞介素18,应用于畜牧业生产。【方法】将含有山羊白细胞介素(gIL)-18基因的重组质粒pET-32a(+)在大肠杆菌BL21(DE3)中以1mmol·L-1IPTG诱导4h或者更长时间进行表达。【结果】经SDS-PAGE试验检测到了gIL-18与pET载体融合表达的重组蛋白。以该重组蛋白与佐剂混合后,免疫小鼠制备多克隆血清。经Western-blotting试验证实该重组蛋白具有免疫原性。经过包涵体变性、层析柱纯化和复性,证实该蛋白具有诱导MDBK细胞分泌IFN-γ和刺激PBMC增殖的生物学活性。这表明重组蛋白保留了天然蛋白大部分的...
关键词：
山羊 白细胞介素-18 表达 活性
[期刊] 水产学报
[作者]
李健 孟繁星 黎明 王日昕 石戈
实验从大弹涂鱼皮肤组织转录组中筛选出大弹涂鱼IL-8基因,并分析了其序列特征,构建了系统发生树,评估了IL-8基因在健康个体不同组织中的表达差异,以及在不同病原体刺激下IL-8基因在机体主要免疫器官肝脏和脾脏中的表达情况。结果显示,该基因的开放阅读框由306个碱基组成,编码101个氨基酸残基,包含典型的由18个氨基酸残基组成的信号肽,和1个由62个氨基酸残基组成的SCY结构域,该结构域还包含了4个保守的半胱氨酸残基,分别为Cys-30、Cys-32、Cys-57和Cys-73。大弹涂鱼IL-8氨基酸序列中的受体结合位点基序ELR (Glu-Leu-Arg)被Asn-Ser-His (NSH)取代,系统进化分析表明,纯化选择影响了鱼类该基序的多样性,且IL-8基因在大弹涂鱼乃至硬骨鱼中不可取代。荧光定量实验结果显示,IL-8基因在大弹涂鱼的健康组织中广泛表达,在鳃和脑中表达量最高。细菌和poly(I∶C)注射实验表明,在受到感染后,肝、脾和脑组织中IL-8的表达量均上调,说明IL-8基因在大弹涂鱼肝、脾和脑组织的炎性反应和免疫应答中起到了重要作用,为大弹涂鱼免疫基因的后续研究提供了参考。
[期刊] 水产学报
[作者]
邱丽华 郭奕惠 张汉华
Interleukin-1β(IL-1β) is one of the most pleiotropic cytokines and a central regulator of the immune and inflammatory responses. Interleukin-1β was initially discovered within mice and humans and over the last 10 years has been characterized within a wide variety of animals. The IL-1β plays a key ro...
关键词：
细胞因子 白细胞介素1β 鱼类
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王存波 常国斌 周琼 廖菁 龚琳琳 陈蓉 胡国顺 雷黎丽 张海波 王克华 包文斌 陈国宏
【目的】以白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)基因为候选基因,研究其单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP),及其与部分免疫性状的关系。【方法】根据红色原鸡IL-1β基因序列设计引物一对,利用PCR-SSCP方法检测了如皋鸡、文昌鸡以及安卡鸡IL-1β基因内含子1、2的SNP,同时检测了56日龄的血清IL-1浓度、异嗜性粒细胞/淋巴细胞(heterophil/lymphocyte,H/L)值、绵羊红细胞(sheep red blood cell,SRBC)抗体滴度、新城疫(newcastle disease,ND)抗体滴度、...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王芳 胡波 任雪枫 范志宇 张则斌 徐为中 何孔旺
用RT-PCR方法对ConA刺激后的新西兰白兔外周血淋巴细胞(PBMC)扩增家兔γ-干扰素(IFN-γ)基因并进行测序,测序结果显示,与GenBank公布的序列核苷酸同源性达到99.4%～99.6%,氨基酸同源性为98.8%～99.4%;然后通过克隆、转化将家兔γ-干扰素基因转入转移载体pFastBacTM1,得到重组转移载体pFastBacTM1-IFN-γ,用pFastBacTM1-IFN-γ转化含有穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经筛选得到重组穿梭载体Bacmid-IFN-γ,用此质粒转染Sf9昆虫细胞,得到重组病毒rAcV-Bac-IFN-γ,经RT-PCR鉴定...
关键词：
家兔 γ-干扰素 克隆 重组杆状病毒
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