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[期刊] 水产学报
[作者]
张秋爽 叶彩媚 牛银杰 林强 梁红茹 罗霞 李宁求 付小哲
为了研究鳜弹状病毒(SCRV)如何调控鳜c-Myc (Sc-c-Myc)进而调控谷氨酰胺代谢的分子机制，本研究通过免疫共沉淀联合蛋白质谱寻找可能与Sc-c-Myc互作的病毒蛋白，初步分析确定为核衣壳蛋白(N蛋白)；Co-IP结果显示，SCRV的N蛋白与Sc-c-Myc存在相互作用。通过PCR扩增获得了带有Flag标签序列的SCRV-N基因的ORF片段，并构建了SCRV-N蛋白过表达载体pcDNA-N-Flag；将pcDNA-N-Flag质粒转染鳜脑组织细胞系(CPB细胞系)，荧光共定位结果显示，Sc-c-Myc与SCRV-N在细胞质内存在共定位现象；通过逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)和免疫印记(Western blot)检测转染pcDNA-N-Flag的CPB细胞系中Sc-c-Myc及谷氨酰胺代谢通路关键酶(GLS1、GDH和IDH2)的表达变化，发现Sc-c-Myc、GLS1的转录水平和蛋白水平均显著上调。综上表明，SCRV的N蛋白与Sc-c-Myc互作促进Sc-c-Myc的表达，进而调控宿主细胞谷氨酰胺代谢途径，为SCRV防控提供了新的靶点。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
郭茜茜 付小哲 梁红茹 林强 刘礼辉 牛银杰 李宁求
为探究鳜弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus, SCRV)复制增殖与谷氨酰胺还原性代谢(reductive glutamine metabolism, RGM)途径的相互作用关系,以鳜脑细胞系(Chinese perch brain cells, CPB)为增殖体系,采用实时荧光定量PCR技术检测病毒拷贝数和RGM途径关键酶mRNA表达水平变化,并通过蛋白免疫印迹方法检测RGM途径关键酶蛋白表达水平变化。结果发现,当培养基缺失谷氨酰胺时SCRV拷贝数降低了99.5%,表明谷氨酰胺是SCRV增殖所必需;而SCRV感染上调CPB细胞RGM途径关键酶的表达,其中异柠檬酸脱氢酶2(isocitratedehy drogenase2,IDH2)上调倍数最大,表明SCRV感染上调了细胞RGM途径中关键酶基因的表达;同时,抑制细胞RGM途径关键酶的表达导致SCRV病毒产量显著下降,表明RGM途径有利于SCRV复制增殖;进一步敲降细胞IDH2基因表达可显著抑制SCRV N蛋白表达,而过表达细胞IDH2基因可显著促进SCRV N蛋白表达,表明IDH2在病毒增殖中具有重要作用。综上所述, SCRV感染可调控CPB细胞RGM通路以满足其自身增殖,其结果可为阐明鳜弹状病毒病致病机制和抗病毒治疗策略提供新的思路。
[期刊] 水产学报
[作者]
沈海洋 卢志杰 秦真东 赵丽娟 李亚男 刘春 杨光 叶成凯 易敢峰 林蠡
为探讨C-Myc表达、谷氨酰胺代谢和神经坏死病毒复制三者之间的关系，本研究首先克隆了斜带石斑鱼鳍条细胞（GF-1）中的C-Myc基因（GF-1-C-Myc），结果显示GF-1-C-Myc 基因cDNA全长814 bp，开放阅读框（ORF）有285 bp，编码95个氨基酸(aa)，有亮氨酸拉链结构域与螺旋－环－螺旋(HLH)结构域。表达和纯化了GF-1-C-Myc 蛋白，并制备其多克隆抗体。采用实时定量PCR技术（qRT-PCR） 与免疫印迹法（WB）检测了GF-1-C-Myc 基因的表达和神经坏死病毒的复制。结果显示，缺乏谷氨酰胺会同时抑制GF-1-C-Myc基因的表达和NNV的复制，添加谷氨酰胺可同时促进GF-1-C-Myc的表达和NNV的复制；此外，NNV感染可上调GF-1-C-Myc 基因的表达，并显著消耗GF-1 细胞培养液中的谷氨酰胺。研究表明，GF-1-C-Myc基因可调控宿主谷氨酰胺代谢，从而有利于神经坏死病毒的复制。本结果为防控神经坏死病毒的感染提供了参考。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
程巧芬 徐幸莲 周光宏
以猪肉为原料 ,根据中心复合旋转试验设计原理 ,采用响应曲面法研究转谷氨酰胺酶及非肉蛋白对肉制品质构性能的影响。 0 ,1 5 ,5 ,8 5 ,10 g·kg-1的转谷氨酰胺酶分别与 0 ,5 ,2 0 ,35 ,4 0 g·kg-1大豆分离蛋白、酪蛋白、乳清浓缩蛋白、卵清蛋白组成 4个试验组 ,室温催化反应 2h ,经 85℃ 30min蒸煮处理后冷却至 4℃ ,进行质构和蒸煮损失测定。结果显示 ,转谷氨酰胺酶可催化非肉蛋白和肉蛋白质之间的反应 ,可使终产品硬度提高 30 0～ 4 0 0g ,弹性提高0 15～ 0 3,凝聚性提高 0 15～ 0 2。此外还可降低产品的蒸煮损失 ...
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
张春红 张佰清 孙焕 刘长江
利用氮气和微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)对大豆分离蛋白(SPI)进行了复合改性。复合改性SPI的吸水性、保水性和吸油性分别比对照提高121%、222%和156%,溶解性比对照降低35.5%。经MTG改性后SPI可在其分子间生成共价键,形成相对分子量较大的聚合物。复合改性可在MTG改性的基础上进一步增加SPI分子间的交联程度。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
臧学丽 陈光
【目的】研究大豆种类、凝固酶种类及反应条件对大豆蛋白凝胶特性的影响。【方法】选择6种优质大豆品种吉农34、吉农28、吉农18、吉农17、吉农芽豆及北豆28,对其大豆蛋白质含量及凝胶强度进行分析;然后以未添加酶组为空白对照,分析加入转谷氨酰胺酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶对大豆蛋白凝胶强度的影响;并通过响应面优化试验与Design-Expert8.0数据处理软件,对高强度大豆蛋白凝胶的制作工艺进行优化;通过扫描电镜和圆二光谱,对转谷氨酰胺酶作用前后大豆蛋白的凝胶构象进行表征。【结果】6种大豆中,吉农
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
梁红茹 范芷仪 蔡秀珠 付小哲 林强 刘礼辉 黄志斌 牛银杰 林蠡 李宁求
【目的】建立鳜弹状病毒(SCRV)和传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的双重PCR检测方法。【方法】分别针对SCRV N基因和ISKNV MCP基因的保守区域设计特异性引物,通过优化退火温度和引物用量(μL)比,建立SCRV和ISKNV的双重PCR检测方法,并对该方法的敏感性和特异性进行检验。应用建立的双重PCR方法对20份临床样品进行单一和双重PCR检测,比较单一和双重PCR的检测结果。【结果】成功建立了SCRV和ISKNV双重PCR方法,该法特异性较强,对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、神经坏死病毒(NNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)等鱼类常见病毒无扩增;敏感性较好,对2种病毒DNA的检测下限均为0.01 ng/μL。20份临床样品的双重PCR样品检测结果显示,3份为SCRV阳性,11份为ISKNV阳性,2份为SCRV和ISKNV混合感染,结果与单一PCR检测结果一致。【结论】建立的SCRV和ISKNV双重PCR检测方法特异性较强,敏感性较好,可用于鳜鱼SCRV与ISKNV的快速鉴别诊断和分子流行病学调查。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张志宏 田文儒 李辉辉 张启耀 高善颂
【目的】研究谷氨酰胺(Gln)对小鼠肝脏、子宫、卵巢组织热休克蛋白70(Hsp70)表达以及对小鼠早期胚胎体外发育的影响。【方法】选取24只8w健康的雌性昆明小白鼠并随机分成4组,Ⅰ组为对照组,尾静脉注射生理盐水,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别注射不同剂量的Gln,注射后4h处死,取肝脏、子宫和卵巢,采用RT-PCR和WesternBlot法检测HSP70mRNA和HSP70的表达;用添加不同浓度Gln的葡萄糖-CZB培养液对小鼠早期胚胎进行体外培养,观察囊胚发育率和孵出率,用WesternBlot方法检测小鼠囊胚Hsp70的表达。【结果】Gln注射组鼠组织中Hsp70表达量均高于对照组,且Hsp70表达量...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
易林 安玥琦 张晗玮 熊善柏
为探究不同品种淡水鱼转谷氨酰胺酶（transglutaminase,TGase）对肌球蛋白凝胶特性的影响，以鲢和青鱼肌球蛋白为试验对象，分别测定鲢转谷氨酰胺酶（silver carp transglutaminase,STG）和青鱼转谷氨酰胺酶（black carp transglutaminase,BTG）作用下肌球蛋白在低温凝胶化后溶解度、蛋白聚集、流变学特性、穿刺特性和微观形貌的变化。结果显示：与未加酶组相比，添加2种TGase后均可催化鲢或青鱼肌球蛋白交联形成更多的ε-(γ-Glu)-Lys异肽键，导致肌球蛋白重链（myosin heveay chain,MHC）的聚集程度增加，蛋白浊度值及平均粒径显著增大（P<0.05），肌球蛋白凝胶的弹性模量（G'）明显增大，凝胶破断力和破断距离显著提升（P
[期刊] 水产学报
[作者]
罗霞 付小哲 李宁求 林强 黄志斌 张悠
为获知鳜弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)QY株在体外培养细胞中最适增殖条件,以鳜脑细胞系(Chinese perch brain cell line,CPB)为增殖体系,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)技术所测病毒拷贝数为判断指标,比较同步接毒和异步接毒2种接种方式以及病毒接种量、血清浓度等培养条件对病毒增殖的影响,确定SCRV-QY株在CPB细胞中的最适增殖条件。结果显示,单位体积病毒增殖量方面,异步接毒法优于同步接毒法,以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10将病毒接种长满单层的CPB细胞中,28°C吸附1.5 h,用含2%胎牛血清的L15培养液于28°C培养时,病毒增殖量最高,为5.59×10~(10)拷贝/mL;而从单位成本所获病毒量考虑,同步接毒法筛选出的4种增殖条件单位成本所获的病毒产量优于异步接毒法,其中当MOI=0.03、胎牛血清终浓度为6%时,同步接种对数生长中期的CPB细胞,28°C恒温培养70 h后收获病毒液,单位成本所获病毒量最高,为4.88×10~(13)个拷贝/元。综上所述,本研究以病毒增殖量和培养基成本作为考量,优化SCRV-QY株的增殖条件,可为SCRV疫苗低成本、规模化生产提供理论依据。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
黄耀凌 邹思湘
用两批各 48只小鼠分 4组 (n =12 )每天分别灌喂生理盐水和 3 4mmol·kg-1的谷氨酰胺、谷氨酸和天冬酰胺 ,连续 10d。结果显示 ,三者都可提高小鼠血清、肝和骨骼肌中的肌酸磷酸激酶活性 ,降低乳酸脱氢酶活性 ,并显著增加肝、骨骼肌糖原积累。其中有相同碳架结构的谷氨酰胺、谷氨酸能极显著提高小鼠的游泳耐力 ,但与谷氨酰胺有相等酰胺氮的天冬酰胺作用不强。结果提示 ,谷氨酰胺提高机体抗疲劳作用与其碳架结构有关
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
楼望淮 蒋甲福 陈素梅 房伟民 陈发棣 管志勇 廖园
采用PCR扩增菊花B病毒(CVB)外壳蛋白基因的开放阅读框,构建酵母双杂交系统所需的诱饵表达载体pGBKT7-CVBCP,测序验证后转化Y2HGold酵母菌。将酵母菌Y187/pGADT7-cDNA与酵母菌Y2HGold/pGBKT7-CVBCP进行交配转化,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal平板上筛选蓝色阳性克隆并测序pGADT7-cDNA的插入片段。结果表明:诱饵载体表达产物对酵母无毒性作用,且对报告基因无自激活作用。筛选菊花cDNA文库初步得到了与CVB外壳蛋白相互作用的E3泛素连接酶ARIADNE-like蛋白和ATP结合蛋白,为进一步研究CVB外壳蛋白与寄...
[期刊] 水产学报
[作者]
刘青云 李强勇 王韶韶 朱威霖 彭敏 曾地刚 陈秀荔 杨春玲 赵永贞 彭金霞 何苹萍 韦嫔媛 陈晓汉
为了探究LvRab5B蛋白在凡纳滨对虾抗病毒感染中的作用,实验分别构建了LvRab5B蛋白在昆虫和酵母细胞中的融合表达载体,将不同的载体导入不同的细胞中,利用免疫荧光和酵母双杂交的方法研究了Lv Rab5B蛋白在昆虫细胞中的表达以及Lv Rab5B蛋白与病毒IHHNV之间的互作关系;通过qRT-PCR方法研究了该蛋白在健康对虾不同组织中的表达情况以及凡纳滨对虾分别感染IHHNV和WSSV后不同时间点的相对表达量。结果显示,Lv Rab5B基因融合蛋白能够在昆虫细胞中表达;Lv Rab5B蛋白与IHHNV病毒衣壳蛋白CP无相互作用,而与非结构蛋白NS1相互作用明显,与非结构蛋白NS2作用较弱。qRT-PCR结果显示,LvRab5B基因在凡纳滨对虾心脏、鳃腺、肠道、胃、肝胰脏和肌肉中都表达,在肠道中表达量最高,肝胰脏次之;Lv Rab5B蛋白在凡纳滨对虾机体感染病毒前后的表达情况不同,感染初期表达降低,随后迅速上升,末期下降。研究表明,LvRab5B基因参与凡纳滨对虾抵抗IHHNV和WSSV病毒的先天免疫过程,为进一步研究Lv Rab5B蛋白在对虾机体中的免疫功能及作用机制奠定了基础。
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
陈静 王丽 王彤 刘显军 李海东 程奇
为研究谷氨酰胺对断奶仔猪血清、肌肉生化指标和和肌肉热休克蛋白表达的影响，选用（２８±１）ｄ断奶的长白×大约克夏仔猪３２头，随机分为２组，对照组饲喂基础日粮，谷氨酰胺组饲喂添加１．２％谷氨酰胺的基础日粮，试验期２８ｄ。试验结束采集仔猪血清和肌肉，测定血清和肌肉生化指标及肌肉中热休克蛋白表达情况。结果表明：仔猪日粮中添加谷氨酰胺有提高仔猪血清总蛋白、白蛋白、球蛋白，并降低了蛋白质系数的趋势（ｐ＞０．０５）。谷氨酰胺显著提高了肌肉谷胱甘肽（ｐ＜０．０５）和谷胱甘肽－Ｓ转移酶的含量（ｐ＜０．０５），显著降低了γ－Ｌ－谷氨酰转肽酶（ｐ＜０．０５）和丙二醛含量（ｐ＜０．０５），但对肌肉中超氧化物歧化酶活性．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李保玲 李颖 范鑫 马文慧 曹云刚
【目的】探究焦磷酸钠(sodium pyrophosphate,PP)、谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TG)及其组合(PP+TG)对氧化损伤猪肉肌原纤维蛋白(myofibrillar protein,MP)凝胶性能的影响,为改善氧化损伤蛋白的功能特性提供理论依据。【方法】从猪背最长肌中提取MP,采用亚油酸-脂肪氧合酶氧化体系诱导MP发生氧化,然后分别添加PP(1 mmol·L~(-1))、TG(E﹕S=1﹕500)及其组合(PP+TG)。采用圆二色谱探究不同添加处理对氧化损伤MP溶液二级结构的影响;通过内源性色氨酸荧光测定探究MP三级结构的变化;通过粒度、溶解度及SDS-PAGE探究不同处理对MP交联聚集情况的影响;借助物性测试仪探究MP凝胶强度的变化;采用离心法测定凝胶持水性的变化;通过分光测色计测定其白度变化;借助扫描电镜观察MP凝胶的微观结构。【结果】PP处理明显改变了氧化损伤MP的构象,使氧化MP的平均粒径明显减小、溶解度显著增强,在增强凝胶强度的同时显著提高了其持水性能(P<0.05),凝胶的微观结构也明显比氧化损伤MP凝胶更规则、均匀、细腻和致密。TG处理显著改善了MP凝胶强度,但对其持水性能并无积极影响;凝胶的微观结构孔径变小、结构致密的同时,仍存在形状不规则、表面粗糙等问题。综合来看,PP+TG协同使用效果最好,氧化损伤MP的凝胶强度及持水性显著增强,且明显好于未氧化MP的凝胶性能。【结论】焦磷酸钠与谷氨酰胺转氨酶的协同使用可以有效改善氧化损伤MP的凝胶性能。
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