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[期刊] 中国水产科学
[作者]
付小哲 李宁求 彭媛媛 林强 石存斌 黄志斌 吴淑勤
从患传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)病的鳜体内获得ORF093基因。采用PCR方法扩增ISKNV ORF093基因全长,克隆入原核表达载体pET32a(+),IPTG诱导表达,Ni柱纯化后,免疫新西兰大白兔制备兔抗重组093蛋白血清,免疫印记分析兔抗血清的特异性,中和实验和免疫保护实验分析重组093蛋白的免疫原性。结果显示:ISKNV重组093蛋白可以在大肠杆菌中以包涵体形式存在;制备的兔抗血清可以特异性识别重组093蛋白,对ISKNV具有中和作用,可给鱼体提供至少10 d的100%预防保护;重组093蛋白...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
王庆 罗永文 刘春 曾伟伟 张超 石存斌 吴淑勤
鳜传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)全基因组序列于2001年完成测定,全基因组为111362bp,含有124个推测的开放阅读框(ORF)。2007年,Eaton等对12株已完成序列测定的虹彩病毒代表株进行分析比较,除了已经推测的ORF外,认为ISKNV基因组中还存在一个的核心基因(Core gene)ORF90.5L。本研究以ISKNV的cDNA为模板,根据Eaton等报道中推测的上下游位点设计引物扩增出一段963bp的PCR产物。该序列编码一个320个氨基酸的蛋白质,推测分子量为35kD,含有预测的跨膜区,...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
付小哲 李宁求 彭媛媛 石存斌 白俊杰 吴淑勤
将大肠杆菌重组表达的鳜(Siniperca chuatsi)传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)主衣壳蛋白(MCP),以不同剂量(20μg/尾、50μg/尾、100μg/尾)腹腔注射免疫幼鳜(2月龄),测定各免疫组的血清抗体效价变化规律、头肾淋巴细胞增殖刺激指数(SI)、肝脏Mx蛋白表达及相对免疫保护率(RPS)。结果表明,各免疫组抗体效价在第14天时达到峰值,其中50μg/尾免疫组的抗体效价最高,随后各组的效价均下降,至第35天时与对照组无差异;头肾淋巴细胞经LPS、ConA刺激后,50μg/尾免疫组及100μg/尾免疫组的刺激指数均升高,其中50μg/尾免疫组的刺激指数最高,20μg/尾免疫组...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
吉尚雷 张培军 卢玉婷 王建超 李月红
【目的】克隆传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)CJ-13株糖蛋白(G蛋白)基因,构建原核表达载体,并检测其在大肠杆菌BL21中的表达情况,为IHNV诊断试剂盒和疫苗的研制奠定基础。【方法】设计1对G基因特异引物对G基因进行RT-PCR扩增,将扩增产物克隆到pGEM-T Easy载体上,构建重组质粒pGEM-T Easy-G,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将G基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,构建传染性造血器官坏死病病毒G基因原核表达质粒pET-32a-G,转化至宿主菌BL21中,诱导表达目的蛋白,采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA等方法对表达产物进行分...
[期刊] 水产学报
[作者]
付小哲 李宁求 林强 刘礼辉 吴淑勤
为了建立鳜传染性脾肾坏死病毒（ＩＳＫＮＶ）疫苗抗原含量的ＥＬＩＳＡ检测方法，制备了３株抗ＩＳＫＮＶ主衣壳蛋白（ＭＣＰ）的单克隆抗体，鉴定了其生物学特性。将大肠杆菌表达的重组ＭＣＰ纯化复性后，连续３次免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，然后将免疫小鼠的脾细胞与ＳＰ２／０细胞融合，经过克隆、筛选，获得３株能稳定分泌抗ＩＳＫＮＶ ＭＣＰ蛋白的单克隆抗体阳性细胞株，分别命名为５Ｆ１、３Ｄ９和５Ｂ４，均为Ｉｇ ｇ１亚型。间接ＥＬＩＳＡ实验表明，３株单抗可特异性识别ＩＳＫＮＶ，与鳜弹状病毒、大鲵虹彩病毒等无交叉反应。将５Ｆ１株免疫小鼠后制备腹水，以重组ＭＣＰ和ＩＳＫＮＶ细胞培养物上清液为检测抗原，ＥＬＩＳＡ检测腹水效价．．．
[期刊] 水产学报
[作者]
胡先勤 付小哲 董星星 涂加钢 赵丽娟 林强 李宁求 林蠡
为研究鳜亲环蛋白（ＣｙｐＡ）在传染性脾肾坏死病毒（ＩＳＫＮＶ）感染中的作用，通过ＲＴ－ｐＣＲ克隆了ＣｙｐＡ全长开放读码框（ＳＣ－ＣｙｐＡ）。结果表明ＳＣ－ＣｙｐＡ基因全长４９５ ｂｐ，编码１６４个氨基酸，分子量为１７．５９ Ｋｕ。通过ｂｌＡＳＴ比对和同源性进化分析，发现其与人、鼠、原鸡和斑点鲖等物种的ＣｙｐＡ具有高度相似性，表明ＳＣ－ＣｙｐＡ属于ＣｙｐＡ家族的成员。环孢素Ａ（ＣＳＡ）具有免疫抑制作用，是ＣｙｐＡ的抑制剂。结果发现，ＣＳＡ浓度与ＩＳＫＮＶ增殖具有一定的剂量依赖关系；ＣＳＡ作用不同时间对ＩＳＫＮＶ均有抑制效果；ＣＳＡ对ＩＳＫＮＶ感染诱导的细胞因子的表达具有调节作用，能抑制Ｉｌ－１β．．．
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
丁国伟 李琛 李玉安 叶正琴 宋庆庆
为研制检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的试剂盒,对IBRV gD蛋白主要功能域的表达及免疫原性进行研究。根据NCBI数据库录入的1型牛疱疹病毒(bovine herpesvirus type 1)gD蛋白序列(Gen Bank登录号为NC_001847)设计引物,用PCR扩增gD基因类免疫球蛋白结构域,构建原核表达载体pET32a–Δg D,转化大肠杆菌Rosseta(DE3)感受态细胞,并诱导重组蛋白表达。经SDS–PAGE分析,获得了相对分子质量约43 000的目的蛋白,该蛋白的相对分子质量与gD
[期刊] 水产学报
[作者]
翁少萍 邓敏 何建国 吕玲 何华虹 龙綮新
测定了鳜传染性脾肾坏死病毒 (ISKNV)核糖核酸酶III(RNaseIII)基因的核苷酸全序列。该基因完整读码框为 771bp ,GC含量为 5 2 .5 3% ,编码一个长为 2 5 6个氨基酸、分子量为 2 8.9kD的推定蛋白。其上下游序列各有一个TATAbox ,终止子下游有一段回文序列。与其它物种相比 ,ISKNV与虹彩病毒 (包括LCDV - 1和CIV)的核糖核酸酶III基因的氨基酸序列同源性较高 ,与酵母、线虫等物种的相应基因的同源性较低
[期刊] 水产学报
[作者]
邓敏 何建国 翁少萍 吕玲 何华虹 龙綮新
报道了鳜传染性脾肾坏死病毒 (ISKNV)的p31基因结构及其序列分析。对ISKNVDNAHindIIIE酶切片段的序列分析结果发现该序列中含有完整的p31基因。ISKNVp31基因完整读码框为 6 75bp ,GC含量为 4 9.78% ,等电点为 7.6 1,编码一个长为 2 2 5aa、分子量为 2 5 .3kD的推定蛋白。结构分析发现该基因具有启动子元件TATAbox和CAATmotif,下游有反向重复序列可形成茎环 ,另外还有一段直接重复序列和二联体结构。ISKNV与其它 3种虹彩病毒 (包括FV3、LCDV - 1和EHNV)的p31基因氨基酸序列具有一定的同源性 ,但ISKNV与...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
赵永欣 赵丽丽 刘巍巍 王建楠 李一经 乔薪瑗 葛俊伟 刘敏
应用RT-PCR方法扩增了长度为1176 bp的IHNV-ZYX株编码核衣壳(N)蛋白基因,将N基因克隆至原核表达载体pET30b,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中得到了表达。通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到了预期大小约48 KD的N蛋白,与理论值相符;提取N蛋白的包涵体,并制备抗血清。间接ELISA和Western-blot-ting实验结果说明,表达的N蛋白与天然的IHNV N蛋白一样具有相同的抗原性。本试验结果为进一步研究分离株IHNV-ZYX N基因的免疫功能,建立灵敏高效的检测传染性造血组织坏死病的方法和研制基因工程疫苗奠定了重要的物质基础。
[期刊] 水产学报
[作者]
赵丽丽 刘敏 哈卓 刘巍巍 赵永欣 葛俊伟 乔薪瑗 李一经
应用RT-PCR方法扩增了IPNV编码内衣壳VP3蛋白的基因615bp,将VP3基因克隆至原核表达载体pET30b,并在大肠杆菌BL21中得到了表达。通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到了预期大小约30ku的VP3蛋白,与理论值相符,经薄层扫描分析表明目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的30%。用镍离子亲和层析柱纯化可溶性的VP3蛋白,并制备抗血清。Western-blotting结果显示,VP3蛋白可被兔抗IPNV阳性血清识别;间接ELISA结果显示,IPNV细胞培养物作为抗原,兔抗VP3蛋白高免血清稀释度为1∶25600时,P/N>2,抗血清可与IPNV全病毒发生反应,以上两项结果说明...
[期刊] 水产学报
[作者]
徐黎明 刘洪柏 卢彤岩
基质蛋白(matrix protein,M)是传染性造血器官坏死病毒(infectious haematopoieticnecrosis virus,IHNV)主要结构蛋白之一,是病毒感染后造成细胞凋亡的主要作用蛋白。为分析IHNV M蛋白的序列及结构特征,研究利用敏感细胞(EPC)培养传染性造血器官坏死病毒-Sn分离株(IHNV-Sn),根据M蛋白基因开放阅读框(open reading frame,ORF)的序列设计引物,利用RT-PCR的方法克隆得到M蛋白全长ORF,并且构建至表达载体pET27b(+)中,构建出pET27-M重组质粒。生物信息学分析结果显示,M蛋白基因的序列长度为588...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
蒋会婷 于三科 冯平 江海燕 王希良
对破伤风毒素C基因(TTC)进行了克隆,在大肠杆菌中构建了C基因-硫氧还蛋白融合表达系统并对其进行了重组表达,对表达后蛋白进行了纯化和rTTC的免疫原性初步研究。结果表明,该系统可高水平表达可溶性rTTC,rTTC表达量占可溶性蛋白的28.19%,纯化后纯度为96.92%;所获得的rTTC具有良好的免疫原性,可为开发新一代破伤风亚单位疫苗奠定基础。
关键词：
破伤风毒素 C基因 免疫原性 C蛋白
[期刊] 华北农学报
[作者]
张莉 康雪燕 章振华 李永清 盖丽丽 姜世金 张培君
为了获得具有良好免疫活性的基因工程抗原蛋白，利用毕赤酵母真核表达系统，表达猪传染性胃肠炎（河北分离株）的纤突糖蛋白。根据Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ＴＧｅＶ Ｓ基因设计一对引物，经ＰＣＲ扩增出长２．２ ｋＢ的目的基因Ｓ，将Ｓ基因亚克隆于Ｐ ＰＩＣ９ｋ载体，转化ＴＯＰ１０感受态，ＰＣＲ、酶切鉴定阳性克隆，ＳａｌⅠ线性化重组穿梭质粒ＰＰＩＣ９ｋ－Ｓ，然后电转ＧＳ１１５感受态，利用Ｇ４１８抗性进行多拷贝整合子初步筛选，提取基因组并做ＰＣＲ鉴定，得到阳性菌株，经诱导发酵后，上清发酵液经ＳＤＳ－ＰａＧｅ电泳检测，显示获得分子量为８２ ｋＤａ左右的目的蛋白，同时用ＷｅＳＴｅＲｎ－ＢｌＯＴＴＩｎＧ检测到一条特异的目的．．．
[期刊] 水产学报
[作者]
邓敏 何建国 翁少萍 曾征 龙綮新
鳜传染性脾肾坏死病毒（ＩＳＫＮＶ）是近年来危害广东地区鳜养殖业的主要病原。本文用回接感染健康鳜获得病毒原料，分离纯化了大量高纯度的ＩＳＫＮＶ病毒粒子，电镜下可见病毒粒子为二十面体，直径平均为１５０ｎｍ。抽提病毒核酸，对其基因组ＤＮＡ进行酶切分析，病毒基因组为双链ＤＮＡ分子，表现脊椎动物虹彩病毒基因组的特点即其胞嘧啶５’端高度甲基化。以限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ和ＰｓｔＩ酶切ＩＳＫＮＶ基因组ＤＮＡ，经电泳分离后，分别得到１、８、９、１８、２２条清晰的酶切片段，并根据酶切片段算得基因组的大小超过１０８．７ｋｂｐ。
关键词：
鳜 传染性脾肾坏死病毒 纯化 酶切分析
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