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[期刊] 西南农业学报
[作者]
张进忠 孙嘉曼 李朝生 刘挺燕 范燕萍
【目的】AGPase基因可在百合鳞茎膨大发育过程中影响淀粉的合成代谢,从而调控鳞茎发育,构建干扰AGPase基因RNAi载体并遗传转化进行反向下调作用研究,可为该调控机制的研究提供更多信息。【方法】克隆300 bp的AGPase基因保守序列,利用Gateway技术通过BP反应将该序列插入入门载体p DONR221,进行LR反应将该序列正反向插入干扰载体p Jawohl8-RNAi中,经过酶切鉴定所构建RNAi载体的正确性;并通过农杆菌介导法转入百合组培苗中,PCR检测RNAi载体转化农杆菌,荧光定量PCR检测农杆菌转化植株的AGPase相对表达量变化。【结果】成功构建p DONR221-AGPase入门克隆与p Jawohl8-RNAi-AGPase表达载体,遗传转化百合愈伤诱导出AGPase表达量下调的转化植株。【结论】采用Gateway技术可方便构建RNAi表达载体,选择的AGPase保守序列能作为干扰片段对百合AGPase自身转录的mRNA进行下调。
[期刊] 草业科学
[作者]
张亚楠 蔺银鼎 孟林 毛培春 田小霞 郭强
重金属ATP酶基因HMA2介导的Cd长距离运输对植物体内Cd的分配及解毒起重要作用。然而,有关马蔺(Iris lactea)体内Cd长距离运输的分子机制仍不清楚。本研究以马蔺根中总RNA为模板,采用RT-PCR方法获得了重金属ATP酶基因片段,以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础,采用酶切和连接的方法,构建了CaMV35S启动子驱动的含有IlHMA2基因片段反向重复序列的RNAi植物表达载体pARTG1G2,用冻融法将此重组质粒导入农杆菌GV3101,并转入到马蔺幼苗体内获得了Il
[期刊] 华北农学报
[作者]
公鑫 王业红 张剑峰 迟胜起
RPP13是一种能够通过识别病原物效应子诱发植物免疫反应的典型R基因。植物病毒学实验室前期对马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)所侵染的5个马铃薯品种进行了转录组测序分析，发现RPP13基因在5个马铃薯品种中均上调。为了研究该基因在马铃薯中是否与PSTVd抗性相关，应用DNAMAN 8.0软件对转录组测序所得到的RPP13上调基因序列进行序列比对分析，选取其共同的保守区域作为沉默对象，构建了以该保守区域为臂，马铃薯体细胞胚发生激酶类似受体基因(SERK1)(登录号为EF175216)内含子为环的茎环结构反向重复序列RNAi载体pROKⅡ-RPP13,通过冻融法将pROKⅡ-RPP13载体转入农杆菌LBA4404中，应用农杆菌介导的马铃薯遗传转化方法转化马铃薯品种民丰红，以苗龄28 d的健康马铃薯叶片为材料，经过预培养2 d、农杆菌浸染10 min、黑暗条件下共培养2 d,应用抗性筛选培养基诱导生根、生芽，将再生植株进行PCR检测，筛选得到3株阳性转基因植株；以马铃薯的ef1a基因作为内参基因，利用实时荧光定量PCR技术检测马铃薯转化植株中RPP13基因的表达量。结果表明：所获得的3株转基因植株中RPP13基因的表达量与未转基因的对照相比具有显著差异，在所获得的RNAi转基因马铃薯植株中，RPP13基因表达量的降低幅度为35%～60%。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
闵东红 陈阳 霍冬英 胡笛 赵月 徐兆师 张小红 李连城 陈明 马有志
干旱、高盐和病虫害严重影响了作物的产量和品质。ERF(ethylene responsive factor)转录因子是介导生物和非生物胁迫响应的重要调控因子。本实验室从小麦中克隆到抗逆相关ERF转录因子W17基因,本研究以植物表达载体pAHC25为基础,构建了含有反向重复序列的RNAi表达载体pAHC-W17RNAi。采用基因枪法45枪轰击小麦品种新春9号幼胚材料2 379个,共获得115株T0代再生植株,其中12株为阳性转基因植株。半定量RT-PCR分析表明,转基因植株中W17基因及其调控的下游基因的表达水平均显著下降;表型鉴定发现转基因小麦苗期发育受到抑制。本研究为深入分析小麦ERF基因的...
[期刊] 华北农学报
[作者]
李海青 柳絮 王庆国 姚方印 刘炜
白藜芦醇是植物遭受胁迫时自身分泌的一种可抵御病菌感染的抗菌素,对真菌具有一定的抑制作用。而白藜芦醇合成酶在白藜芦醇合成途径中具有关键性的作用。水稻稻瘟病作为一种由真菌引起的严重病害,具有高发性、毁灭性的特点,对水稻品质及生产危害极大。本研究从花生中分离到白藜芦醇合酶基因PNRSC,通过基因工程的方法构建入经改造的以玉米泛素Ubi为启动子、以生物安全性的bar基因为选择标记的植物双元表达载体pCAM-BIA1300中,经农杆菌介导对黄淮稻区主栽品种圣稻13进行遗传转化,经Basta抗性鉴定及分子筛选,证明白藜芦醇合成酶基因已整合入水稻基因组,并获得转基因株系。目前转基因植株已移栽至大田,为进一步...
[期刊] 华北农学报
[作者]
李臻 张贵林 王庆国 柳絮 李海青 姚方印 刘炜
水稻黑条矮缩病是由水稻黑条矮缩病毒引起的水稻病害,该病可导致病株生长迟缓、矮化、抽穗结实困难,严重影响了水稻的生产。在水稻黑条矮缩病毒基因组不同双链RNA序列的基础上,分别设计了5对特异性引物,通过RT-PCR获得了相应片段,结合基因沉默的方法,分别构建RNA干扰载体,并进一步将发夹结构构建入以玉米泛素Ubi为启动子、以bar基因为选择标记的改造后的植物双元表达载体pCA1300-Ubi中,经农杆菌介导对黄淮稻区主栽水稻品种圣稻13进行遗传转化,成功获得了5个含有水稻黑条矮缩病干扰片段的植物双元表达载体,经农杆菌介导获得了部分水稻转化植株。旨在为下一步对水稻黑条矮缩病的研究及抗病水稻新品种的培...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
乔亚红 田桂英 郑银英 崔百明 李诗林 向本春
【目的】利用农杆菌介导法将抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12转入红番3号加工番茄,获得抗CMV和ToMV的加工番茄植株,为加工番茄病毒病的防治奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增,选取新疆加工番茄CMV分离物NS0-4 1a复制酶第1 051-1 350bp序列和ToMV分离物SCS-2 130/180ku复制酶第1 920-2 200bp序列,作为干扰片段CR12和To12。通过T克隆载体将CR12和To12连接成拼接片段TC12,构建成含反向重复结构拼接片段的RNAi表达载体pBi35STC12。通过农杆菌介导法,用其转化红番3号加工番茄,经过筛选、PCR检测得到转...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
高永峰 刘继恺 范晶 彭奕 黄科 张敦房 刘永胜
【目的】穗发芽是种子在收获前遇到阴雨潮湿环境时,在田间母体植株上发芽的现象,是水稻生产中的一个重要限制因素。水稻穗发芽的表现性状和玉米种子特异的viviparous1(vp1)突变体表型非常相似。VP1是种子成熟和休眠所必须的脱落酸信号转导途径中的重要转录因子,因此利用转基因技术研究水稻同源基因OsVP1的生物学功能对有效控制杂交水稻穗发芽的发生和危害具有重要意义。【方法】将水稻OsVP1片段导入到植物表达载体pHB,构建OsVP1的RNA干涉植物表达载体pHB-OsVP1RNAi;通过根癌农杆菌介导转入水稻品种日本晴,并获得阳性植株。【结果】半定量RT-PCR分析显示,转基因植株胚中的OsV...
关键词：
OsVP1 RNA干涉 农杆菌 水稻
[期刊] 华北农学报
[作者]
于丛丛 马俊莲 宋春丽 陈佳
据已测序的上西早生柿ETR5基因序列,设计了2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个ETR5-Uenishiwase基因片段。2个片段经单酶切消化后连接成反向互补的大片断。连接片断经双酶切消化后,定向连接到植物表达载体pSMAK321的35S启动子和NOS终止子之间,构建成Uenishiwase-ETR5基因的RNA干扰植物表达载体。载体质粒经酶切鉴定正确后通过冻融法转入根癌农杆菌EHA101中。以上西柿组培苗叶片为外植体,优化遗传转化体系,结果表明:农杆菌重悬液和共培养基中均添加200μmol/L的AS及Spc梯度筛选能有效提高转化率。转化植株经PCR检测得到7...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
韩海燕 李定琴 黄兴奇 余腾琼 殷富有 张敦宇 付坚 程在全
稻瘟病是水稻上最重要的病害之一。本研究所用Pi-ta+基因是一个来自景洪直立型紫秆普通野生稻的基因,该基因属于稀有的抗稻瘟病Pi-ta+等位基因,具有抗稻瘟病的能力;几丁质酶是一种以几丁质为底物的水解酶,它可以降解病原真菌细胞壁中的几丁质,破坏细胞新物质的沉积使病原体死亡。为获得抗稻瘟病的水稻新材料和进一步培育聚合多个抗稻瘟病基因的转基因水稻新品种,本研究采用一种新的方法构建了Pi-ta+和Bchi的双价表达载体pCAMBIA1300-Pi-ta+-Bchi,通过农杆菌介导法转入栽培稻品种云资粳41中,经过一定浓度的甘露糖筛选培养,分化得到的再生苗经氯酚红显色法和PCR检测,获得11棵转基因阳...
[期刊] 华北农学报
[作者]
付振艳 刘峰 苟小清 王晓军
小麦TaNADP-ME1基因对干旱、盐、低温等非生物胁迫作出响应。利用重组技术成功构建了TaNADP-ME1的植物表达载体pCAME1,农杆菌介导法成功转化水稻品种日本晴成熟胚诱导的愈伤组织,通过潮霉素筛选获得了抗性愈伤,分化和生根后获得转化植株,PCR鉴定获得20株转基因水稻苗。结果为进一步确定TaNADP-ME1的基因功能奠定了基础。
关键词：
TaNADP-ME1 转化 水稻
[期刊] 华北农学报
[作者]
付振艳 苟小清 张正斌 肖向文 王晓军
小麦TaNADP-ME2是一光反应基因,并对干旱、盐、低温等非生物胁迫作出响应。构建TaNADP-ME2基因的重组植物表达载体,并转化水稻获得转基因植株。利用重组技术构建植物表达载体,冻融法转化农杆菌,农杆菌介导方法转化水稻成熟胚诱导的愈伤组织,潮霉素筛选和PCR鉴定转基因植株。成功构建了重组植物表达质粒pSUE2,并将pSUE2转入农杆菌EHA105,潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因和TaNADP-ME2基因PCR鉴定获得16棵转基因阳性水稻植株。为进一步确定TaNADP-ME2基因的水分利用效率功能奠定了基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张学明 宋阳 王丕武 马建 晏佳琳 付永平 曲静 张卓 董环宇 李琦
【目的】应用RNA干扰技术,同时抑制大豆凝集素(Soybean agglutinin,SBA)和脂肪氧化酶(Lipoxygenase,Lox)基因在种子中的表达,改良大豆营养品质,为培育优质大豆材料奠定基础。【方法】根据RNAi原理,酶切获得Lox目的片段,构建以除草剂Bar基因为筛选标记、种子特异性启动子P7αP启动SBA和Lox双干扰的pCAMBIA3301-SBA-Lox(pSBA-Lox)干扰表达载体,并通过农杆菌介导法转化大豆(品种为吉农28),采用PCR、Southern杂交和实时荧光定量PCR对转基因植株进行检测。【结果】质粒PCR和酶切鉴定结果表明,双价RNAi植物表达载体pS...
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