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[期刊] 淡水渔业
[作者]
周勇 范玉顶 徐进 马杰 江南 刘文枝 曾令兵
根据鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,Cy HV-2)ORF 4基因序列(Gen Bank:JQ815364.1)设计特异性引物,PCR扩增得到ORF 4基因编码框全长序列1 041 bp,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-ORF 4。将p ET-32a-ORF 4重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到融合表达的重组蛋白,融合表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,其分子质量约为57 ku,与预期大小一致
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
杨毅 李莉娟 陈孝煊 袁军法
以感染锦鲤疱疹病毒的患病鱼为材料,通过RT-PCR克隆ORF134的编码序列,在细胞水平分析其表达模式,并在原核表达系统中表达,获得可溶性的ORF134重组蛋白。结果表明ORF134在锦鲤疱疹病毒裂解感染中转录,证实ORF134为非结构功能基因。ORF134全长为624 bp,含有1个内含子,编码179个氨基酸,序列分析显示ORF134同已报道的高等脊椎动物病毒编码的vIL-10具有较低的序列同源性,但具有较高的结构相似性。体外表达分析显示ORF134呈分泌性表达,但不能形成寡聚体,与其他病毒编码的vIL-10具有差异。进一步通过原核表达获得可溶性的ORF134重组蛋白。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
孔善云 姜有声 许丹 谢骏 吕利群
Ⅱ型鲤疱疹病毒（ｃｙｐｒｉｎｉｄ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ２，ｃｙ ｈｖ－２）是引起养殖异育银鲫（ｃａｒａｓｓｉｕｓ ａｕｒａｔｕｓ ｇｉｂｅｌｉｏ）造血器官坏死症的致病病原。在临床筛查中基于病毒核酸的ｐｃｒ和ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｐｃｒ技术已经建立，但是稳定性更强的免疫学诊断技术国内外尚无报道。本研究目的是利用ｃｙ ｈｖ－２编码的ｏｒＦ７２基因（ｇｅｎ ｂａｎｋ登录号：ａＦＪ２０５０２．１）所编码的衣壳蛋白作为捕获抗原，通过识别感染病毒的鱼体中的相应抗体，从而对样本进行临床免疫学检测。首先采用ｐｃｒ方法从纯化的ｃｙ ｈｖ－２基因组中扩增ｏｒＦ７２基因，并把该基因克隆至原核表达载体ｐｇｅＸ－４ｔ．．．
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
张淑敏 白昌明 辛鲁生 李亚楠 李晨 王崇明
本研究对编码牡蛎疱疹病毒(Ostreid herpesvirus 1,OsHV-1)囊膜蛋白的orf111基因进行了生物信息学分析、克隆和表达。首先,通过特异性PCR扩增得到orf111基因全长序列,并对其编码囊膜蛋白的理化性质、高级结构、跨膜区和抗原决定簇等进行生物信息学分析。结果显示,orf111编码一种稳定的疏水性蛋白,具有5个跨膜结构域和9个抗原决定簇,同时,氨基酸序列中还包含1个高度保守的精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)结构域。随后,构建了pET28a-orf111重组质粒,并将其转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。最后,通过使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,表达产物分子量约为32 kDa。本研究应用原核表达得到了含RGD结构域的OsHV-1囊膜蛋白,为进一步制备ORF111蛋白单克隆抗体及开展牡蛎疱疹病毒侵染机制的研究奠定了重要基础,为将来OsHV-1的防控工作提供新的思路。
关键词：
牡蛎疱疹病毒 囊膜蛋白 原核表达 魁蚶
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
李友娟 郭凤达 葛均青 林天龙
将鳗鲡疱疹病毒(AngHV)福建株(AngHV-FJ)ORF51基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,构建表达质粒pGEX-4T-2-ORF51,将其转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导后,收集表达菌体,进行SDS-PAGE分析和免疫印迹试验验证,结果表明,获得了高效表达的AngHV-FJ ORF51融合蛋白.经割胶回收纯化,获得高纯度的融合表达蛋白.用纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的兔抗ORF51多克隆抗体.这为进一步研究ORF51蛋白的结构和功能及开展AngHV病的防治研究提供了重要的研究基础.
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
彭俊杰 张琪 贾路路 林蠡 袁军法 曾令兵 周勇 刘学芹
利用PCR方法扩增鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)ORF25基因的部分基因序列,并将扩增产物连接到原核表达载体pGEX-KG,成功构建了CyHV-2-ORF25-KG重组质粒。IPTG将其诱导后,SDS-PAGE分析表明:目的蛋白得到表达,分子质量大小为42ku,且主要以包涵体形式存在;用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,多次免疫后通过细胞融合,筛选出1株单抗5C6;经间接免疫荧光试验和Western blot试验验证,这株单抗可以识别CyHV-2ORF25蛋白。
[期刊] 水产学报
[作者]
夏思瑶 王浩 Patorida Podok 许丹 姜有声 吕利群 佐野元彦
为研究鲤疱疹病毒Ⅱ型（Ｃｙ ＨＶ－２）体外感染复制特征以及异育银鲫抗病毒免疫应答反应。本实验采用组织块培养法建立了异育银鲫背鳍细胞的原代培养体系。结果显示，在１０ ｄ左右可观察到组织块迁移分离出新的单层细胞，３周左右细胞可覆盖底部面积为２５Ｃｍ２培养瓶的底部；经Ｃｙ ＨＶ－２悬液感染离体培养的原代细胞，３ ｄ后病毒滴度增殖至１０６拷贝／ｍ Ｌ；在病毒感染６ ｄ后出现典型的细胞病变效应；Ｃｙ ＨＶ－２感染原代细胞后，分析前期通过鱼体水平实验鉴定出的与该病毒感染相关的免疫基因：ＰＮＰ５ａ、ｍＰＯ、ｍＨＣⅠ、ＬｙＺ－Ｃ、ＩＬ－１１、ＩＴＬＮ、ＰＮＰ５ａ和ｄＵＳＰ，ＲｅａＬ－ＴＩｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ结果．．．
[期刊] 中国水产科学
[作者]
郑树城 李莹莹 王庆 曾伟伟 王英英 任燕 石存斌
为了对鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)ORF136基因编码蛋白进行功能研究和血清学诊断,本实验通过对ORF136基因推导的第31157位氨基酸序列进行PCR扩增,并与原核载体pET-32a(+)连接,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态后进行IPTG诱导表达,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔(Oryctolagus cuniculus)以制备ORF136多克隆抗体,运用Western blot和间接免疫荧光技术对抗体进行鉴定。结果表明,重组融合表达蛋白大
[期刊] 淡水渔业
[作者]
周勇 史玉恒 范玉顶 刘文枝 江南 赵建青 许晨 曾令兵
鲫(Carassius auratus)造血器官坏死症是我国养殖鲫中新出现的一种传染性病毒性疾病,其病原为鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2),为研制针对该病的有效诊断试剂和疫苗,分析了Cy HV-2 ORF25基因编码蛋白的抗原表位,利用原核表达系统对Cy HV-2 ORF25编码蛋白富含抗原表位的区域进行截短表达,制备了抗Cy HV-2 ORF25编码蛋白的多克隆抗体,通过间接免疫荧光和免疫保护力测定等实验研究了截短表达蛋白的免疫原性。结果显示,原核表达的截短蛋白t ORF25分子质量约为28 k W,蛋白纯化后免疫日本大耳兔制备的多克隆抗体可特异性识别在Gi CB上增殖的Cy HV-2。将截短表达蛋白t ORF25免疫异育银鲫后,感染Cy HV-2,其相对免疫保护率达47%。
[期刊] 水产学报
[作者]
周井祥 李新伟 王好 吕文亮 朱霞
为了解锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF81蛋白的结构特征和进化关系,用框镜鲤尾鳍原代细胞增殖KHV-CJ,提取其DNA,经PCR扩增,获得ORF81基因,将其克隆到pMD18-T载体中,构建重组质粒。应用生物信息学方法初步分析KHV-CJ ORF81基因的结构和功能,并与GenBank上已公布的3株KHV构建系统进化树。结果显示,获得了长771 bp的ORF81基因,编码256个氨基酸;预测ORF81基因的理论分子量为28 246.50 u,等电点为8.404;疏水性大于亲水性;信号肽切割部位最可能位于29位的S(丝氨酸);有4个跨膜区;抗原表位预测显示抗原性良好;结构预测显示,不...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
赵欣 贾鹏 刘莹 王津津 史秀杰 潘广 郑晓聪 于力 何俊强 刘荭 吴志新
本研究建立了定量检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,并与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测方法的灵敏性、重复性、特异性和临床样品检测做了比较分析。结果表明,与qPCR相比,ddPCR具有相同的特异性,其灵敏性比qPCR低20倍。在定量CyHV-2 DNA时,ddPCR(R2=0.994)和qPCR(R2=0.994)均表现出良好
[期刊] 水产学报
[作者]
周勇 曾令兵 张辉 范玉顶 徐进
针对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)DNA解旋酶基因编码区序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增出长度为1 446 bp的基因编码区片段,克隆到pMD19T载体上,构建重组质粒。经PCR鉴定与测序分析确认正确后,以10倍梯度稀释重组质粒,作为标准模板进行TaqMan real-time PCR扩增,制作标准曲线,建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型的荧光定量PCR检测方法。检测结果显示,标准曲线的相关系数(R2)达到0.999 1,斜率为-3.412;对初始模板定量检测的范围为1×101～1×107copies/μL;特异性试验结果表明,该方法可特异性地检测出鲤疱疹...
[期刊] 水产学报
[作者]
余琳 吕利群 王浩
针对CyHV-2病毒ORF121基因(GenBank:AFJ20543.1)进行原核表达系统的构建,将纯化重组蛋白作为抗原来免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,应用该抗体开展CyHV-2病毒诊断及其感染机制研究。以CyHV-2病毒感染细胞上清液为扩增模板,扩增ORF121基因构建至pGEX-4T原核表达载体,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达rORF121重组蛋白,利用尿素纯化后免疫6周龄BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,CyHV-2病毒ORF121基因可在原核表达系统中高效表达目的重组蛋白rORF121,经SDS-PAGE分析大小约为60 ku,主要以不可溶的包涵体存在。利用尿素溶解rORF121蛋白免疫BALB/c小鼠获得抗ORF121蛋白的多克隆抗体,Western Blot实验显示,该抗体可特异性识别CyHV-2病毒感染RyuF-2细胞样品。研究表明,利用CyHV-2感染RyuF-2细胞后,本研究制备的抗ORF121蛋白的多克隆抗体能够通过间接免疫荧光实验特异性识别CyHV-2病毒感染的细胞样品。本研究制备的抗ORF121蛋白的多克隆抗体,能够为CyHV-2病毒诊断技术的构建以及深入开展CyHV-2病毒感染机制提供良好的技术基础。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
吴静 刘振兴 马艳平 梁志凌 马江耀 郝乐 柯浩 冯国清 李玉谷
鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)又称为锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus, KHV),是一种高传染性、致死性病毒。为开发新型CyHV-3 DNA疫苗,前期研究中将CyHV-3 ORF148基因插入pEGFP-N1构建重组质粒,在此基础上,本研究通过转染试验、间接免疫荧光试验证实pORF148-EGFP融合蛋白可以在CCB-J细胞系和建鲤体内表达;将重组质粒作为DNA疫苗,肌肉注射免疫建鲤鱼苗,ELISA检测表明免疫pEGFP-ORF148重组质粒可以显著提高建鲤血清特异性抗体水平; RT-qPCR检测显示,免疫pEGFP-ORF148重组质粒后,建鲤脾脏和头肾中的免疫相关基因如IFN-a1、Mx-1、CXCa、CXCR1、TNF-α、IL-1β及IgM基因表达量均显著提高。攻毒实验显示, CyHV-3攻毒21 d后, PBS组、pEGFP-N1组和pEGFP-ORF148组的建鲤存活率分别为30%、35%和85%,免疫pEGFP-ORF148可以显著提高建鲤的存活率(P
[期刊] 水产学报
[作者]
李聪慧 徐进 刘文枝 周勇 曾令兵
为建立一种操作简单、结果准确可靠、结果判定直观、成本低廉的现场快速检测方法,为锦鲤疱疹病毒(Koi herpes virus,KHV)疾病的防控提供技术支撑,根据KHV保守的DNA聚合酶(DNA polymerase,Sph)基因,设计一组单交叉扩增引物,以构建的Sph基因重组质粒作为标准DNA模板,采用单交叉引物等温扩增技术(single cross priming amplification,SCPA)进行扩增,优化反应体系的引物浓度组合、Mg2+浓度、d NTPs浓度、反应温度和时间,并结合核酸试纸条技术(nucleic acid test strip detection method)...
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