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[期刊] 水产学报
[作者]
夏思瑶 王浩 Patorida Podok 许丹 姜有声 吕利群 佐野元彦
为研究鲤疱疹病毒Ⅱ型（Ｃｙ ＨＶ－２）体外感染复制特征以及异育银鲫抗病毒免疫应答反应。本实验采用组织块培养法建立了异育银鲫背鳍细胞的原代培养体系。结果显示，在１０ ｄ左右可观察到组织块迁移分离出新的单层细胞，３周左右细胞可覆盖底部面积为２５Ｃｍ２培养瓶的底部；经Ｃｙ ＨＶ－２悬液感染离体培养的原代细胞，３ ｄ后病毒滴度增殖至１０６拷贝／ｍ Ｌ；在病毒感染６ ｄ后出现典型的细胞病变效应；Ｃｙ ＨＶ－２感染原代细胞后，分析前期通过鱼体水平实验鉴定出的与该病毒感染相关的免疫基因：ＰＮＰ５ａ、ｍＰＯ、ｍＨＣⅠ、ＬｙＺ－Ｃ、ＩＬ－１１、ＩＴＬＮ、ＰＮＰ５ａ和ｄＵＳＰ，ＲｅａＬ－ＴＩｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ结果．．．
[期刊] 淡水渔业
[作者]
周勇 范玉顶 徐进 马杰 江南 刘文枝 曾令兵
根据鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,Cy HV-2)ORF 4基因序列(Gen Bank:JQ815364.1)设计特异性引物,PCR扩增得到ORF 4基因编码框全长序列1 041 bp,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-ORF 4。将p ET-32a-ORF 4重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到融合表达的重组蛋白,融合表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,其分子质量约为57 ku,与预期大小一致
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
刘文枝 曾令兵 张辉 杨星 徐进 江南 周勇 马杰
鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirusⅡ,CyHV-2)感染异育银鲫(Carassius auratus gibelio)是近年新出现的一种严重病毒性疾病,已经造成重大经济损失,目前缺乏有关该病发病机理的相关研究。以CyHV-2感染异育银鲫的患病鱼内脏组织超微过滤匀浆液,腹腔注射感染健康异育银鲫,分别对感染组与对照组鲫尾静脉采血,进行白细胞分类计数、吞噬细胞活性检测以及血清生化指标测定与分析。结果表明,与对照组相比较,感染组鲫血细胞总数变化不明显,但单核细胞和淋巴细胞百分比显著上升,其中淋巴细胞上升呈极显著差异(P<0.01),单核细胞上升呈显著差异(0.01
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
杨毅 李莉娟 陈孝煊 袁军法
以感染锦鲤疱疹病毒的患病鱼为材料,通过RT-PCR克隆ORF134的编码序列,在细胞水平分析其表达模式,并在原核表达系统中表达,获得可溶性的ORF134重组蛋白。结果表明ORF134在锦鲤疱疹病毒裂解感染中转录,证实ORF134为非结构功能基因。ORF134全长为624 bp,含有1个内含子,编码179个氨基酸,序列分析显示ORF134同已报道的高等脊椎动物病毒编码的vIL-10具有较低的序列同源性,但具有较高的结构相似性。体外表达分析显示ORF134呈分泌性表达,但不能形成寡聚体,与其他病毒编码的vIL-10具有差异。进一步通过原核表达获得可溶性的ORF134重组蛋白。
[期刊] 水产学报
[作者]
高娃 温虹 王浩 陆佳荃 吕利群 姜有声
为了鉴定CyHV-2的主要免疫原性蛋白，本研究用分离的CyHV-2-YC-1分离株感染异育银鲫尾鳍细胞系（GiCF），用蔗糖密度梯度超速离心法对细胞感染液中的CyHV-2进行纯化，纯化后的CyHV-2病毒免疫小鼠制备抗CyHV-2多克隆抗体。纯化的病毒颗粒经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色后，用抗CyHV-2多克隆抗体进行Western blotting分析和质谱鉴定。结果显示，透射电镜观察下发现50%～66%的蔗糖梯度多见完整囊膜包裹的CyHV-2病毒颗粒，也有少量囊膜破损的病毒颗粒。Western blotting结果显示，抗CyHV-2多克隆抗体与多种病毒蛋白具有特异性免疫反应，质谱鉴定显示，其中8种主要免疫原性蛋白分别是ORF92、ORF115、ORF25、ORF57、ORF66、ORF72、ORF131和ORF132。研究表明，通过蔗糖密度梯度超速离心法提纯CyHV-2病毒颗粒后，本研究制备的抗CyHV-2多克隆抗体能够特异性识别CyHV-2病毒的主要免疫原性蛋白。本研究将为CyHV-2免疫学检测方法的建立以及疫苗的研制提供更多的候选抗原。
关键词：
鲤疱疹病毒Ⅱ型 免疫原性 蛋白 质谱鉴定
[期刊] 西南农业学报
[作者]
李小凤 阮志华 石勇丽 武晓倩 韦悠 万丽军 谢志勤 任红玉 谢芝勋
【目的】分析血清4型禽腺病毒（FAdV-4）Ⅷ蛋白（Protein Ⅷ，pⅧ）对宿主天然免疫相关基因表达的影响，为进一步研究FAdV-4的致病机理提供参考依据。【方法】通过PCR扩增FAdV-4Ⅷ基因编码区序列，与pEF1α-HA载体连接，构建重组表达质粒pEF1α-HA-Ⅷ。用pEF1α-HA-Ⅷ重组表达质粒（试验组）和pEF1α-HA空质粒（对照组）转染LMH细胞，利用Western blotting和间接免疫荧光验证Ⅷ蛋白表达情况，实时荧光定量PCR测定STING、MDA5、TBK1、MAVS、NF-ΚB、IRF7、IFN-α、INF-β、IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β基因的表达水平。【结果】Ⅷ基因开放阅读框（ORF）全长744 bp，共编码247个氨基酸残基，真核表达获得的Ⅷ重组蛋白与鼠源HA标签单克隆抗体产生特异性反应，在34 kD处得到单一条带；间接免疫荧光检测可见绿色荧光，说明Ⅷ重组蛋白在LMH细胞中得到良好表达。与对照组相比，Ⅷ重组蛋白在LMH细胞中表达后，模式受体STING基因的表达水平显著提高了5.6倍（P<0.05，下同），MDA5基因的表达水平提高了30%；接头蛋白TBK1和MAVS基因表达水平分别较对照组显著提高了1.5和2.4倍；转录因子IRF7的表达水平显著提高了3.4倍，而NF-ΚB基因被抑制表达。同时，干扰素（IFN-α和IFN-β）和白介素（IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β的表达水平均上调，IFN-α和IFN-β分别极显著上调19.2和14.4倍（P
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
傅一鸣 李智 柳峰松 刘利平
对凡纳滨对虾进行血窦注射微囊藻毒素MC-LR染毒,取染毒前后肝胰腺及血细胞,采用Illumina Hiseq 2500测序平台进行基因表达谱分析,并对差异基因的基因本体(gene ontology,GO)注释和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路进行显著性富集分析。结果发现,酚氧化酶原、胰蛋白酶及C型凝集素等基因有显著的差异性表达。在GO富集性分析中发现细胞粘附显著性差异表达,细胞杀伤及细胞粘附分子结合物差异表达。KEGG富集性分析发现血细胞中吞噬体显著性差异表达,细胞凋亡、内吞作用和细胞粘附分子等通路呈表达差...
关键词：
凡纳滨对虾 微囊藻毒素 转录组 细胞免疫
[期刊] 淡水渔业
[作者]
卢俊 陆宏达 岳蒙蒙 操艮萍
以患鲤疱疹病毒２型（Ｃｙｐｒｉｎｉｄ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ２，Ｃｙ ｈｖ－２）疾病的异育银鲫（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ ａｕｒａｔｕｓ ｇｉｂｅｌｉｏ）肾脏为实验材料，采用－２０℃冷冻、１００％乙醇、ｄａｆａｎｏ＇ｓ液、１０％福尔马林、Ｚｅｎｋｅｒ＇ｓ液、Ｍüｌｌｅｒ＇ｓ液、２．５％戊二醛、ｈｅｌｌｙ＇ｓ液、ＭｏｓｓＭａｎ＇ｓ液、ｂｏｕｉｎ＇ｓ液和Ｃａｒｎｏｙ＇ｓ液不同方法进行保存，通过微量分光光度计检测和琼脂糖凝胶电泳探讨不同保存方法对病毒ｄｎａ提取效果、常规ｐＣｒ扩增效果和巢式ｐＣｒ扩增效果的影响。结果表明：从病鱼肾脏中提取ｄｎａ时，除１００％乙醇保存方法与－２０℃冷冻保存组一样可以提取高质．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
吴春涛 王建华 侯相山 霍雷 侯艳梅 牛钟相
用PCR法扩增了牛疱疹病毒Ⅰ型B artha N u/67株gB基因,将其插入原核表达载体pBAD/TOPO中构建重组质粒pBAD-gB。将pBAD-gB质粒转化大肠杆菌TOP 10后进行了诱导表达,对表达产物进行了纯化和抗原性检测,并通过改变诱导剂L-A rab inose的浓度和诱导时间对诱导表达条件进行了优化。结果表明,重组质粒pBAD-gB构建成功,gB蛋白获得了高效表达,并以包涵体形式存在,纯化后gB蛋白的纯度达90%以上,gB蛋白抗原性良好,最佳诱导表达条件:L-A rab inose终浓度为0.2 g/L,诱导时间为5 h。
关键词：
牛疱疹病毒Ⅰ型 gB基因 原核表达
[期刊] 水产学报
[作者]
马杰 周勇 范玉顶 刘文枝 江南 曾令兵
为了查明鲤疱疹病毒Ⅱ型（Ｃｙｐｒｉｎｉｄ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ２，Ｃｙ ｈｖ－２）的理化与生物学特性以及病毒在细胞内的超微形态发生过程，利用新建立的对Ｃｙ ｈｖ－２敏感的异育银鲫脑组织细胞系（Ｇｉ ＣＢ），对Ｃｙ ｈｖ－２的理化及生物学特性进行了详细研究，比较了不同来源鱼类细胞系对Ｃｙ ｈｖ－２感染的敏感性，并对体外培养细胞中Ｃｙ ｈｖ－２病毒粒子及其超微形态发生过程进行了电镜观察。结果显示，Ｃｙ ｈｖ－２对热、酸、碱、有机溶剂和冻融敏感；常用鱼类细胞系ｅｐＣ、ｒＴＧ－２、Ｋｏｉ－Ｆｉｎ、ＣｉＫ、ＣＣＫ、ｐＦ－Ｆｉｎ对Ｃｙ ｈｖ－２的感染不敏感，特异性巢式ｐＣｒ检测盲传至第７代Ｃｙ ｈｖ－．．．
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
孙佳鑫 石连玉 姜晓娜 李池陶 葛彦龙 胡雪松 张晓峰 贾智英
以F_(4)为实验材料,利用实时荧光定量PCR技术以TK和ORF72基因为病毒标志基因，分析镜鲤抗疱疹病毒（CyHV-3）选育抗病品系F_(4)在病毒感染不同阶段中的表达量。结果显示：（1）两个基因不同感染阶段脾、肾组织表达量趋势一致，24～144h呈上升趋势，144～288h呈下降趋势，且在144h脾、肾组织的病毒表达量均达到最高。（2）脾组织两个基因表达量均低于肾组织。选育组两个基因在120h均达到差异极显著(P<0.01)，未选育组两个基因均在96～144h差异极显著（P<0.01）。（3）选育组两个基因表达量低于未选育组。脾、肾组织TK基因均在96～168h差异极显著(P<0.01)；脾、肾组织ORF72基因均在96～192h差异极显著(P<0.01)，其中脾组织216h也差异极显著(P<0.01)。以上结果说明选育组抗病性能强于未选育组，其中肾组织抗病性能强于脾组织，且经选育肾组织抗病免疫性能得到提高。目前，未见其他鱼类的选育种在抗病性状上达到一个稳定阶段，本研究在对于病毒表达量的研究当中可对其他鱼类提供重要的指导作用。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
吴静 刘振兴 马艳平 梁志凌 马江耀 郝乐 柯浩 冯国清 李玉谷
鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)又称为锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus, KHV),是一种高传染性、致死性病毒。为开发新型CyHV-3 DNA疫苗,前期研究中将CyHV-3 ORF148基因插入pEGFP-N1构建重组质粒,在此基础上,本研究通过转染试验、间接免疫荧光试验证实pORF148-EGFP融合蛋白可以在CCB-J细胞系和建鲤体内表达;将重组质粒作为DNA疫苗,肌肉注射免疫建鲤鱼苗,ELISA检测表明免疫pEGFP-ORF148重组质粒可以显著提高建鲤血清特异性抗体水平; RT-qPCR检测显示,免疫pEGFP-ORF148重组质粒后,建鲤脾脏和头肾中的免疫相关基因如IFN-a1、Mx-1、CXCa、CXCR1、TNF-α、IL-1β及IgM基因表达量均显著提高。攻毒实验显示, CyHV-3攻毒21 d后, PBS组、pEGFP-N1组和pEGFP-ORF148组的建鲤存活率分别为30%、35%和85%,免疫pEGFP-ORF148可以显著提高建鲤的存活率(P
[期刊] 中国水产科学
[作者]
孔善云 姜有声 许丹 谢骏 吕利群
Ⅱ型鲤疱疹病毒（ｃｙｐｒｉｎｉｄ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ２，ｃｙ ｈｖ－２）是引起养殖异育银鲫（ｃａｒａｓｓｉｕｓ ａｕｒａｔｕｓ ｇｉｂｅｌｉｏ）造血器官坏死症的致病病原。在临床筛查中基于病毒核酸的ｐｃｒ和ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｐｃｒ技术已经建立，但是稳定性更强的免疫学诊断技术国内外尚无报道。本研究目的是利用ｃｙ ｈｖ－２编码的ｏｒＦ７２基因（ｇｅｎ ｂａｎｋ登录号：ａＦＪ２０５０２．１）所编码的衣壳蛋白作为捕获抗原，通过识别感染病毒的鱼体中的相应抗体，从而对样本进行临床免疫学检测。首先采用ｐｃｒ方法从纯化的ｃｙ ｈｖ－２基因组中扩增ｏｒＦ７２基因，并把该基因克隆至原核表达载体ｐｇｅＸ－４ｔ．．．
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
陈阿琴 刘志伟 吕为群 杨志刚 钟英斌
转化生长因子9(GDF9)与骨形成蛋白15(BMP15)通过受体介导途径,在鱼类卵细胞发育与成熟过程中发挥着重要作用。在GDF9与BMP15信号通路中,GDF9与BMP15的Ⅰ型受体基因分别为TGF-βR1a、TGF-βR1b和BMPR1Ba、BMPR1Bb,两者的Ⅱ型受体基因均为BMPR2a、BMPR2b。本研究以异育银鲫为实验对象,对GDF9和BMP15的各受体基因在卵细胞中的表达模式进行研究。结果显示,在异育银鲫卵细胞发育过程中,TGF-βR1a、BMPR1Ba与BMPR1Bb基因mR NA水平呈先降低后升高的变化趋势,TGF-βR1b基因mR NA水平自Ⅱ期卵细胞开始显著升高,而BMP...
关键词：
异育银鲫 受体基因 卵细胞
[期刊] 水产学报
[作者]
周瑶佳 田思璐 许佳雪 李尹麒 杨悦 耿毅 黄小丽 陈德芳 汪开毓 欧阳萍
为探究疾病病因和流行特点，对病鱼进行剖检、病理学观察、分子生物学检测及人工感染实验。结果显示，患病鲫临床表现为离群独游、浮头、全身发黑、体表出血。剖检发现鳃、肝脏、肾脏等器官出血、肿胀和坏死，鳔点状出血。组织病理观察显示，鳃呼吸上皮细胞肿胀、坏死及脱落；肾脏局灶性坏死；脾脏组织广泛变性坏死，造血系统崩解；肝脏发生空泡变性和坏死。透射电镜观察到脾脏和肾脏中存在4种不同大小的病毒颗粒，分别为DNA病毒内核、空衣壳、实心衣壳和有包膜的成熟病毒粒子。未成熟的病毒粒子存在于细胞核，成熟的病毒粒子存在于细胞质。电镜下可见鲤疱疹病毒II型（CyHV-2）在细胞核内完成核酸复制和核衣壳装配，囊膜蛋白在出核后获得。细胞核萎缩、核染色质边缘化，线粒体肿胀、坏死、嵴断裂，细胞质空泡化。取病鱼组织匀浆滤菌后接种到EPC及FHM细胞系，盲传3代后未见细胞病变。通过腹腔注射病鱼组织匀浆进行人工感染实验，实验组鲫表现出与自然感染鲫相同的临床症状而对照组鲫正常，实验组累积死亡率为80%。用PCR方法检测CyHV-2的解旋酶基因片段，扩增出预期大小相符的目的条带。利用邻近法对该病毒的解旋酶基因进行系统发育分析，结果显示与CyHV-2（YZ-01）的同源性为99%。以上实验结果证实了CyHV-2是这次疾病暴发的原因。
关键词：
鲫 鲤疱疹病毒2型 组织病理 超微病理
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