为了鉴定CyHV-2的主要免疫原性蛋白，本研究用分离的CyHV-2-YC-1分离株感染异育银鲫尾鳍细胞系（GiCF），用蔗糖密度梯度超速离心法对细胞感染液中的CyHV-2进行纯化，纯化后的CyHV-2病毒免疫小鼠制备抗CyHV-2多克隆抗体。纯化的病毒颗粒经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色后，用抗CyHV-2多克隆抗体进行Western blotting分析和质谱鉴定。结果显示，透射电镜观察下发现50%～66%的蔗糖梯度多见完整囊膜包裹的CyHV-2病毒颗粒，也有少量囊膜破损的病毒颗粒。Western blotting结果显示，抗CyHV-2多克隆抗体与多种病毒蛋白具有特异性免疫反应，质谱鉴定显示，其中8种主要免疫原性蛋白分别是ORF92、ORF115、ORF25、ORF57、ORF66、ORF72、ORF131和ORF132。研究表明，通过蔗糖密度梯度超速离心法提纯CyHV-2病毒颗粒后，本研究制备的抗CyHV-2多克隆抗体能够特异性识别CyHV-2病毒的主要免疫原性蛋白。本研究将为CyHV-2免疫学检测方法的建立以及疫苗的研制提供更多的候选抗原。

鲫(Carassius auratus)造血器官坏死症是我国养殖鲫中新出现的一种传染性病毒性疾病,其病原为鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2),为研制针对该病的有效诊断试剂和疫苗,分析了Cy HV-2 ORF25基因编码蛋白的抗原表位,利用原核表达系统对Cy HV-2 ORF25编码蛋白富含抗原表位的区域进行截短表达,制备了抗Cy HV-2 ORF25编码蛋白的多克隆抗体,通过间接免疫荧光和免疫保护力测定等实验研究了截短表达蛋白的免疫原性。结果显示,原核表达的截短蛋白t ORF25分子质量约为28 k W,蛋白纯化后免疫日本大耳兔制备的多克隆抗体可特异性识别在Gi CB上增殖的Cy HV-2。将截短表达蛋白t ORF25免疫异育银鲫后,感染Cy HV-2,其相对免疫保护率达47%。

鲤春病毒血症病毒(SVCV)能够引起鲤科鱼类大量死亡,被世界动物卫生组织(OIE)列为必须申报的重要疫病,也是我国唯一被列为一类疫病的鱼类传染病。为建立SVCV的快速免疫学诊断方法,研究其主要结构蛋白间的免疫原性差异,实验首先采用原核表达系统克隆并诱导表达,纯化SVCV的核蛋白(N)、磷蛋白(P)和基质蛋白(M),并进一步免疫新西兰白兔制备抗血清,抗血清经Protein A柱进一步纯化获得3种蛋白的多克隆抗体。利用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫印迹实验(Western blot)对抗体效价和特异

Ⅱ型鲤疱疹病毒（ｃｙｐｒｉｎｉｄ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ２，ｃｙ ｈｖ－２）是引起养殖异育银鲫（ｃａｒａｓｓｉｕｓ ａｕｒａｔｕｓ ｇｉｂｅｌｉｏ）造血器官坏死症的致病病原。在临床筛查中基于病毒核酸的ｐｃｒ和ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｐｃｒ技术已经建立，但是稳定性更强的免疫学诊断技术国内外尚无报道。本研究目的是利用ｃｙ ｈｖ－２编码的ｏｒＦ７２基因（ｇｅｎ ｂａｎｋ登录号：ａＦＪ２０５０２．１）所编码的衣壳蛋白作为捕获抗原，通过识别感染病毒的鱼体中的相应抗体，从而对样本进行临床免疫学检测。首先采用ｐｃｒ方法从纯化的ｃｙ ｈｖ－２基因组中扩增ｏｒＦ７２基因，并把该基因克隆至原核表达载体ｐｇｅＸ－４ｔ．．．

为了揭示鲤春病毒血症病毒（ｓｐｒｉｎｇ ｖｉｒｅｍｉａ ｏｆ ｃａｒｐ ｖｉｒｕｓ，ｓｖｃｖ）糖蛋白编码基因的主要免疫原性决定区域，本研究对ｓｖｃｖ的糖蛋白基因进行截短表达，并用纯化的重组蛋白作为免疫原制备了兔抗血清以分析其免疫原性。通过ｓｏｓｕｉ以及Ｄｎａｓｔａｒ ６．０软件对ｓｖｃｖ糖蛋白基因的跨膜区、亲水性以及抗原表位进行分析后，采用ｒｔ－ｐｃｒ对该基因主要抗原决定区域编码片段进行扩增，并构建重组表达质粒ｐ ｇｅＸ－ｇｔｒ，对其进行诱导表达后获得截短的ｓｖｃｖ糖蛋白的重组蛋白。将表达的重组蛋白进行纯化复性后，作为免疫原制备兔抗血清，采用ｅＬｉｓａ法检测其效价，采用免疫印迹以及间接免疫荧光．．．

【目的】在昆虫细胞中表达猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S1-NTD蛋白,研究其免疫原性,为基于PEDV S蛋白的基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础。【方法】PCR扩增PEDV S1-NTD基因,构建其重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD和重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD。将Ac-PEDV S1-NTD转染sf9昆虫细胞,利用昆虫杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD。将P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,Western blot鉴定重组蛋白的表达,空斑试验测定重组杆状病毒的滴度。在此基础上,分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.1,1和3的P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,并在感染后1,2,3,4和5 d收集细胞,通过Western blot和空斑试验分别检测目的蛋白的表达量和重组杆状病毒的增殖情况。将MOI为0.1的P3代重组杆状病毒皮下注射免疫BALB/c小鼠,每隔2周免疫1次,共免疫3次,以注射PBS、空载体Bacmid和PEDV商业疫苗为对照组,于首免后不同时间采集血液分离其血清,ELISA法检测血清中PEDV特异性抗体的水平;于首免后35 d剖取小鼠脾脏,分离其淋巴细胞;PEDV刺激后,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖情况。【结果】PCR扩增获得了约738 bp的PEDV S1-NTD基因;成功构建了重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD、重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD和重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD。利用杆状病毒表达系统在sf9细胞内成功表达了重组PEDV S1-NTD蛋白,且杆状病毒以MOI为1感染sf 9细胞后在第3天蛋白表达量达到最高。在首免后35 d,重组杆状病毒免疫组小鼠血清效价达到最高值,为1∶5 000,与商业疫苗组效价一致;淋巴细胞增殖试验表明,重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD免疫组小鼠脾淋巴细胞对PEDV的刺激也发生了显著增殖(P0.05)。【结论】成功构建了重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD,在昆虫细胞中成功表达了PEDV S1-NTD蛋白,且具有较好的免疫原性。

为研制检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的试剂盒,对IBRV gD蛋白主要功能域的表达及免疫原性进行研究。根据NCBI数据库录入的1型牛疱疹病毒(bovine herpesvirus type 1)gD蛋白序列(Gen Bank登录号为NC_001847)设计引物,用PCR扩增gD基因类免疫球蛋白结构域,构建原核表达载体pET32a–Δg D,转化大肠杆菌Rosseta(DE3)感受态细胞,并诱导重组蛋白表达。经SDS–PAGE分析,获得了相对分子质量约43 000的目的蛋白,该蛋白的相对分子质量与gD

将SARS冠状病毒(SARS-CoV)表面的主要结构蛋白刺突蛋白S144-643的基因片段(nt430-nt1929)克隆入表达质粒pET-28b中,并在大肠杆菌中表达。S144-643蛋白分子质量为55 ku左右,以包涵体形式存在于细菌中。ELISA及Western blot证明,S144-643可以与SARS康复病人的阳性血清发生特异性反应,免疫新西兰大白兔可以诱发产生较高水平的特异性抗体,因而证明原核表达的S144-643具有良好的免疫原性。

【目的】研制以杆状病毒表面展示系统为基础的猪瘟基因工程亚单位疫苗。【方法】利用杆状病毒表面展示(Baculovirus display)技术,构建展示猪瘟病毒(CSFV)囊膜蛋白的重组杆状病毒BacSC-E0E1E2,该重组杆状病毒带有His6标签,且胞质区域(CTD)和跨膜区域(TM)均来源于杆状病毒囊膜蛋白gp64的CTD和TM。对重组杆状病毒进行Western blot分析、激光共聚焦显微镜观察、免疫金电子显微镜检测、动物免疫试验、血清中和试验。【结果】Western blot分析结果表明,重组杆状病毒中表达了重组E0E1E2蛋白;激光共聚焦显微镜检测结果表明,重组杆状病毒感染昆虫细胞S...

为建立针对Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒（ＧＣＲＶ）的血清学检测方法，分别构建了ＧＣＲＶ ＪＸ０２株外衣壳蛋白ＶＰ４、ＶＰ３５的原核重组表达质粒ＰＧＥＸ－４Ｔ－３－Ｓ６、ＰＧＥＸ－４Ｔ－３－Ｓ１１，用纯化的重组蛋白Ｒ ＶＰ４、Ｒ ＶＰ３５分别免疫小鼠制得相应的多克隆抗体，用间接ＥＬＩＳＡ方法测定２种抗体的效价，用ＷＥＳＴＥＲｎ ＢＬｏＴ鉴定抗体的特异性。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析细菌表达的Ｒ ＶＰ４、Ｒ ＶＰ３５大小分别约为９８ｋｕ和６１ｋｕ，且都主要以包涵体的形式存在；间接ＥＬＩＳＡ方法测定制备的抗体效价分别约为１：４×１０５和１：１０６；ＷＥＳＴＥＲｎ ＢＬｏＴ结果显示，制备的２种多克隆抗体都既能够识别原核．．．

为研制禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)亚单位疫苗,本研究对FAdV-4的Fiber-2蛋白在毕赤酵母中的发酵工艺进行了优化。首先根据酵母密码子偏好性优化Fiber-2基因,并且构建了重组真核表达载体pPIC9K-Fiber-2。将该质粒转化至毕赤酵母GS115菌株,经不同质量浓度G418筛选获得高拷贝重组菌。随后在摇瓶中进行诱导发酵时温度、时间和甲醇浓度的优化。用优化后的条件进行发酵表达并将上清液通过镍柱纯化得到了重组的Fiber-2蛋白。最后将蛋白与ISA-201-VG油佐剂混合并免疫21日龄SPF鸡进行免疫保护性试验。结果表明:在毕赤酵母中成功且高效的分泌表达了Fiber-2蛋白,分子量约为60ku,在摇瓶发酵中诱导的最佳甲醇浓度、时间和温度分别为1.0%、72h和30℃。优化后发酵液上清中的总蛋白量约为50mg/L,重组Fiber-2蛋白达到8.7mg/L。SDS-PAGE和Western blot结果表明采用镍柱对蛋白进行纯化可得到条带单一且具有良好免疫原性的重组Fiber-2蛋白。免疫保护性试验显示,由优化后的毕赤酵母表达Fiber-2蛋白制备的亚单位疫苗免疫雏鸡后,可以诱导较高的抗体水平并提供高达100%的超强FAdV-4毒株(GD616)的攻击保护。本研究为进一步采用毕赤酵母表达的重组Fiber-2蛋白制备FAdV-4亚单位疫苗的研发奠定了基础。

【目的】表达欧亚类禽型(eurasian avian-like,EA)H1N1猪流感病毒(SIV)的血凝素(HA)蛋白,并对其免疫原性进行测定。【方法】利用RT-PCR技术扩增病毒A/swine/Zhejiang/245/2013(H1N1)(ZJ245)的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS中,获得重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245),将其转染293T细胞,采用间接免疫荧光(IFA)检测和Western blot检测HA蛋白在体外的表达;将重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)经肌肉注射途径、以100μg/只剂量免疫16只6周龄BALB/c小鼠(I组和II组),间隔3周后进行加强免疫(二免);同等数量的小鼠以相同方式注射100μL无菌PBS作为非免疫对照组(III组和IV组)。首免和二免每周采血,分别采用血凝抑制(HI)试验和病毒中和(VN)试验两种方法测定不同类型的血清抗体效价;二免2周后,其中两组小鼠(I组和III组)用50μL(106.0EID50)的ZJ245病毒经滴鼻感染途径进行攻毒,另外两组(II组和IV组)用A/swine/Heilongjiang/44/2009(H1N1)(HLJ44)病毒进行攻毒。攻毒后14 d内每天观察小鼠的临床症状、统计发病与死亡情况,且每天称量小鼠体重,在体重下降比率超过25%时判定为小鼠死亡。攻毒后第3天,每组随机剖杀3只小鼠,分别采集脑、鼻甲、肺、脾和肾等脏器,匀浆处理后通过接种10日龄的非免疫鸡胚测定脏器的病毒含量。通过小鼠体重变化以及脏器滴定的病毒含量评估重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)的免疫保护效果。【结果】经酶切鉴定和测序验证表明ZJ245的HA基因的已正确克隆至真核表达质粒p CAGGS中获得重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245),经体外转染293T细胞后,IFA和Western blot证实了病毒的HA蛋白能够正确表达,并具有良好的生物学活性;小鼠的免疫与攻毒试验结果表明,重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)首免后一周可检测到针对同源病毒ZJ245的低水平HI和VN抗体,加强免疫后抗体水平明显升高,HI抗体达到76.88、VN抗体达到152.5;同时针对异源病毒HLJ44也产生了较低水平的HI和VN抗体。106.0 EID50的同源病毒ZJ245攻毒时,与非免疫组小鼠相对比,重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)的免疫完全阻止了因病毒攻击而导致的小鼠体重下降以及肺脏和鼻甲内病毒的复制;106.0 EID50的异源病毒HLJ44攻毒时,相比非免疫组小鼠,质粒免疫组小鼠体重的下降比率、以及肺脏和鼻甲内的病毒滴度均显著降低(P<0.05)。【结论】重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)能够有效表达病毒HA蛋白,免疫后可使小鼠获得完全抵抗ZJ245感染及部分抵御HLJ44感染的免疫保护力,表明重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)具有良好的免疫原性。

[目的]利用马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)系统高效表达鸭腺病毒3型(DAdV-3)Fiber-2蛋白，用于制备安全、高效、低成本的鸭腺病毒亚单位疫苗。[方法]以食品安全级的马克斯克鲁维酵母为宿主，对DAdV-3 Fiber-2蛋白进行重组表达，建立高密度发酵和纯化工艺，获得目的蛋白并制备成亚单位疫苗，然后进行动物试验。试验分为低剂量组(琼扩效价1∶64,每羽34μg)、高剂量组(1∶128,每羽68μg)、空白组和攻毒对照组，在免疫后第10天和第21天采血检测血清中的抗体水平，攻毒7 d后采肛拭子检测排毒量；通过抗体水平和排毒量评估该亚单位疫苗的保护效果。[结果]通过SDS-PAGE、Western blot和琼脂糖凝胶扩散(AGP)试验验证fiber-2基因在酵母中成功表达。重组菌经高密度发酵，目的蛋白纯化后检测其表达水平，琼扩效价可达1∶128。动物试验结果显示，疫苗免疫组在免疫后第21天所测得血清中的抗体水平显著高于空白组；疫苗免疫组在攻毒7 d后的排毒量显著低于攻毒对照组。[结论]DAdV-3 Fiber-2蛋白能在马克斯克鲁维酵母细胞中进行高效表达，并且用该蛋白制备的亚单位疫苗对鸭3型腺病毒具有一定的保护作用。

为了对鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)ORF136基因编码蛋白进行功能研究和血清学诊断,本实验通过对ORF136基因推导的第31157位氨基酸序列进行PCR扩增,并与原核载体pET-32a(+)连接,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态后进行IPTG诱导表达,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔(Oryctolagus cuniculus)以制备ORF136多克隆抗体,运用Western blot和间接免疫荧光技术对抗体进行鉴定。结果表明,重组融合表达蛋白大

针对CyHV-2病毒ORF121基因(GenBank:AFJ20543.1)进行原核表达系统的构建,将纯化重组蛋白作为抗原来免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,应用该抗体开展CyHV-2病毒诊断及其感染机制研究。以CyHV-2病毒感染细胞上清液为扩增模板,扩增ORF121基因构建至pGEX-4T原核表达载体,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达rORF121重组蛋白,利用尿素纯化后免疫6周龄BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,CyHV-2病毒ORF121基因可在原核表达系统中高效表达目的重组蛋白rORF121,经SDS-PAGE分析大小约为60 ku,主要以不可溶的包涵体存在。利用尿素溶解rORF121蛋白免疫BALB/c小鼠获得抗ORF121蛋白的多克隆抗体,Western Blot实验显示,该抗体可特异性识别CyHV-2病毒感染RyuF-2细胞样品。研究表明,利用CyHV-2感染RyuF-2细胞后,本研究制备的抗ORF121蛋白的多克隆抗体能够通过间接免疫荧光实验特异性识别CyHV-2病毒感染的细胞样品。本研究制备的抗ORF121蛋白的多克隆抗体,能够为CyHV-2病毒诊断技术的构建以及深入开展CyHV-2病毒感染机制提供良好的技术基础。