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[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
彭俊杰 张琪 贾路路 林蠡 袁军法 曾令兵 周勇 刘学芹
利用PCR方法扩增鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)ORF25基因的部分基因序列,并将扩增产物连接到原核表达载体pGEX-KG,成功构建了CyHV-2-ORF25-KG重组质粒。IPTG将其诱导后,SDS-PAGE分析表明:目的蛋白得到表达,分子质量大小为42ku,且主要以包涵体形式存在;用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,多次免疫后通过细胞融合,筛选出1株单抗5C6;经间接免疫荧光试验和Western blot试验验证,这株单抗可以识别CyHV-2ORF25蛋白。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
周勇 史玉恒 范玉顶 刘文枝 江南 赵建青 许晨 曾令兵
鲫(Carassius auratus)造血器官坏死症是我国养殖鲫中新出现的一种传染性病毒性疾病,其病原为鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2),为研制针对该病的有效诊断试剂和疫苗,分析了Cy HV-2 ORF25基因编码蛋白的抗原表位,利用原核表达系统对Cy HV-2 ORF25编码蛋白富含抗原表位的区域进行截短表达,制备了抗Cy HV-2 ORF25编码蛋白的多克隆抗体,通过间接免疫荧光和免疫保护力测定等实验研究了截短表达蛋白的免疫原性。结果显示,原核表达的截短蛋白t ORF25分子质量约为28 k W,蛋白纯化后免疫日本大耳兔制备的多克隆抗体可特异性识别在Gi CB上增殖的Cy HV-2。将截短表达蛋白t ORF25免疫异育银鲫后,感染Cy HV-2,其相对免疫保护率达47%。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
郑树城 李莹莹 王庆 曾伟伟 王英英 任燕 石存斌
为了对鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)ORF136基因编码蛋白进行功能研究和血清学诊断,本实验通过对ORF136基因推导的第31157位氨基酸序列进行PCR扩增,并与原核载体pET-32a(+)连接,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态后进行IPTG诱导表达,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔(Oryctolagus cuniculus)以制备ORF136多克隆抗体,运用Western blot和间接免疫荧光技术对抗体进行鉴定。结果表明,重组融合表达蛋白大
[期刊] 水产学报
[作者]
余琳 吕利群 王浩
针对CyHV-2病毒ORF121基因(GenBank:AFJ20543.1)进行原核表达系统的构建,将纯化重组蛋白作为抗原来免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,应用该抗体开展CyHV-2病毒诊断及其感染机制研究。以CyHV-2病毒感染细胞上清液为扩增模板,扩增ORF121基因构建至pGEX-4T原核表达载体,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达rORF121重组蛋白,利用尿素纯化后免疫6周龄BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,CyHV-2病毒ORF121基因可在原核表达系统中高效表达目的重组蛋白rORF121,经SDS-PAGE分析大小约为60 ku,主要以不可溶的包涵体存在。利用尿素溶解rORF121蛋白免疫BALB/c小鼠获得抗ORF121蛋白的多克隆抗体,Western Blot实验显示,该抗体可特异性识别CyHV-2病毒感染RyuF-2细胞样品。研究表明,利用CyHV-2感染RyuF-2细胞后,本研究制备的抗ORF121蛋白的多克隆抗体能够通过间接免疫荧光实验特异性识别CyHV-2病毒感染的细胞样品。本研究制备的抗ORF121蛋白的多克隆抗体,能够为CyHV-2病毒诊断技术的构建以及深入开展CyHV-2病毒感染机制提供良好的技术基础。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
李友娟 郭凤达 葛均青 林天龙
将鳗鲡疱疹病毒(AngHV)福建株(AngHV-FJ)ORF51基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,构建表达质粒pGEX-4T-2-ORF51,将其转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导后,收集表达菌体,进行SDS-PAGE分析和免疫印迹试验验证,结果表明,获得了高效表达的AngHV-FJ ORF51融合蛋白.经割胶回收纯化,获得高纯度的融合表达蛋白.用纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的兔抗ORF51多克隆抗体.这为进一步研究ORF51蛋白的结构和功能及开展AngHV病的防治研究提供了重要的研究基础.
[期刊] 华北农学报
[作者]
于天飞 谢鹏宇 孙婉姝 李静 尹海畅 黎明 于志丹
为了在大肠杆菌中表达抗鹅细小病毒(GPV) NS1蛋白单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因,并测定其与NS1蛋白结合活性。对抗GPV NS1蛋白单克隆抗体VL、VH基因核苷酸序列依据大肠杆菌偏爱密码子进行优化,人工合成获得了含有可变区基因的重组质粒pUC57-VL和pUC57-VH。然后用Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切pUC57-VL、pUC57-VH,回收340 bp的VL基因和370 bp的VH基因。目的基因通过Bam HⅠ/XhoⅠ多克隆位点分别插入至原核表达载体pET-32a,获得重组质粒pET-VL和pET-VH。重组质粒经Bam HⅠ单酶切和Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切及测序鉴定。重组质粒分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导,获得了重组蛋白TRX-VL和TRX-VH的表达,分子量分别为30.3,31.4 ku。纯化后的重组蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性结合,鉴定结果表明,获得的纯化蛋白为目的蛋白。间接ELISA分析表明,0.4μg的TRX-VH可与25 ng的GST-NS1蛋白特异性结合而0.4μg的TRX-VL不能与各包被量的GST-NS1蛋白特异性结合,TRX-VH与GST-NS1蛋白的特异性结合可被1∶200稀释的GPV感染鹅血清完全阻断。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
杨笑笑 杨兴淼 刘亚林 曹瑞兵
[目的]制备日本脑炎病毒prM蛋白的特异性单克隆抗体，对进一步了解prM的结构和功能、开发特异性检测方法以及JEV prM蛋白的功能研究奠定基础。[方法]将prM基因克隆至原核表达载体pET-32a，诱导表达并纯化prM重组蛋白，随后将其免疫小鼠，通过细胞融合和亚克隆得到分泌抗prM单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水并进行效价测定，通过Western blot和IFA验证其特异性，并进行空斑中和试验测定其中和活性，利用原核表达多段截短体蛋白确定单克隆抗体抗原表位并进行保守性分析，将其初步应用于感染检测及亚细胞定位分析。[结果]经细胞融合和三次亚克隆后成功获得1株能稳定分泌抗prM单克隆抗体的细胞株，命名为4H6，所制备的腹水效价可达到1∶1638400，经鉴定该抗体重链属于IgG2b，轻链为κ型。Western blot以及IFA试验均证明该抗体具有良好的特异性。空斑减少中和试验显示4H6不具备中和活性。通过表达截短蛋白鉴定出4H6所识别的抗原表位位于30GENRCWVRAIDVGYMC45，结合生物信息学分析发现该表位位于prM蛋白表面且在JEV不同毒株之间高度保守，有利于抗原抗体的直接接触。并成功将4H6初步应用于JEV感染检测及prM蛋白亚细胞定位分析。[结论] 成功制备1种高效且特异性的JEV prM蛋白单克隆抗体，抗原表位识别区位于pr，为分析prM蛋白在病毒复制过程中的生物学功能以及与其他病毒蛋白（如E蛋白或宿主分子）之间的相互作用提供有效工具。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
陈静 张艳维 刘琴 朱晓真 贾钊 王俊亚 高娃 贾智英 桂朗 邹钧
白介素（Interleukin，IL）10是 脊椎动物Th2细胞（T helper 2 cell）和先天淋巴细胞（Innate lymphoid cell）分泌的一种多效应细胞因子。3型鲤疱疹病毒（Cyprinid herpesvirus 3， CyHV3）ORF134编码IL10样蛋白，本研究构建了ORF134原核表达质粒，在大肠杆菌DE3感受态细胞中表达CyHV3-IL10重组蛋白。SDS-PAGE分析结果表明，重组CyHV3-IL10蛋白约为18 ku，主要以包涵体形式表达。将CyHV3-IL10包涵体进行变性和复性，经分子筛凝胶柱层析纯化获得了纯度较高的重组CyHV3-IL10蛋白，利用CyHV3-IL10重组蛋白免疫小鼠制备了单克隆抗体，通过酶联免疫吸附测定法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）筛选，获得了2株亲和力强的抗体，并利用激光共聚焦技术和Western blotting对抗体进行了鉴定。结果表明，FITC标记的单克隆抗体能够特异性识别HEK293细胞中表达的CyHV3-IL10重组蛋白和感染CyHV3的镜鲤脾和鳃组织中表达的CyHV3-IL10蛋白。CyHV3-IL10单克隆抗体的制备为后续研究CyHV3-IL10蛋白功能和建立CyHV3诊断方法奠定了基础，为CyHV3病毒检测试剂盒的研发提供了新思路。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
张艳维 张永安 涂加钢
为研究L蛋白在乌鳢水泡病毒(snakehead vesiculovirus, SHVV)增殖过程中发挥的作用,扩增SHVV L基因的前900个碱基,将其克隆到载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET32a-L,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。设置不同温度、IPTG浓度及诱导时间,选择最佳的表达条件。通过NI-NTA亲和层析柱纯化蛋白,并利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。用Western blot鉴定抗体特异性,间接免疫荧光观察L蛋白在SHVV感染斑点叉尾鮰卵巢细胞(channel catfish ovary, CCO)中的定位情况。结果显示,纯化的L蛋白分子质量约42 ku,与预期大小相符。制备的L蛋白多克隆抗体可以与L蛋白发生特异性免疫反应,且L蛋白主要定位在细胞质,表明L蛋白多克隆抗体制备成功。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
赵丹丹 刁有祥 杨国平 陈浩 提金凤 张璐
【目的】制备鸭瘟病毒（ＤＰＶ）ｇＢ蛋白单克隆抗体，为建立ＤＰＶ快速诊断方法及进一步鉴定ＤＰＶ的抗原表位奠定基础。【方法】克隆ＤＰＶｇＢ基因，构建其表达载体并进行原核表达，纯化ＤＰＶ ｇＢ蛋白，以其作为抗原免疫８周龄ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合，进行间接ＥＬＩＳＡ及亚克隆筛选，并对单抗亚类及抗原性进行鉴定。【结果】ＰｃＲ扩增出９１５ＢＰ的目的基因，成功连接于ＰＥＴ－２８Ａ载体，并转化大肠杆菌ＲｏＳＥＴＴＡ进行诱导表达，获得４株稳定分泌抗ＤＰＶ ｇＢ蛋白的杂交瘤细胞株，分别命名为Ａ８Ｄ７、Ｅ６ｃ３、Ｈ１１Ｆ８、Ｈ６Ｆ６，间接ＥＬＩＳＡ检测其腹水效价分别为１∶１０３、１．．．
关键词：
鸭瘟病毒 gB蛋白 单克隆抗体
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
张昭 朱四东 井晓欢 杨季芳 陈吉刚
锯缘青蟹呼肠孤病毒(Scylla serrata reovirus,SsRV)第9节段(S9)编码的p40蛋白可能为病毒的甲基转移酶(methyltransferase)。为了便于确认p40在病毒复制过程中扮演的角色,将S9片段的开放阅读框(ORF)克隆到原核表达载体pET28a(+),实现了在宿主表达菌E.coli BL21(DE3)中的高效表达,进而纯化了重组表达蛋白p40(rp40),并制备了抗SsRV p40蛋白的2株单克隆抗体(4B7、3E5)。经Western blot分析表明,2株单克隆抗体均可特异地识别rp40蛋白,以及识别SsRV病毒蛋白中分子量为46 ku和40 ku 2条...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
曹丙蕾 张群 凌宗帅 邱洪凯 杨超然
采集某发病猪场病料进行疑似PRRSV分离鉴定,经克隆测序获得一株美洲型的高致病性PRRSV SD-TA株分离株,并对其N蛋白(核衣壳蛋白)基因设计引物进行克隆转化,构建重组质粒pET-30a-ORF7,鉴定后经诱导表达纯化获得大小约为21KD(含6×His标签蛋白)的重组N蛋白。将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,经间接ELISA检测后取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,并对融合细胞上清进行抗体检测,通过有限稀释法,获得了2株能稳定分泌抗N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为6D10和3H5,经鉴定后两者均为IgG1型,且识别于不同的抗原位点,经Western-blot和IFA检测,单抗6D10...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
杨振慧 葛均青 刘荭 杨金先 郑晓聪 林天龙
根据鲤春病毒血症病毒(SVCV)基因组序列(GenBank:NC_002803),人工合成M基因开放阅读框序列,克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化工程菌株BL21(DE3),在0.1 mmol.L-1 IPTG、37℃下诱导5 h,获得高效表达的M蛋白,但其主要以包涵体的形式存在,经超声破碎、包涵体纯化后,再经Ni亲和层析柱纯化,获得高纯度的M蛋白.以纯化的M蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备了M蛋白的多克隆抗血清.ELISA检测显示抗血清的效价达1∶128000;western blot分析显示抗血清能够识别SVCV的M蛋白,表明其具有较好的灵敏性和特异性.
[期刊] 西南农业学报
[作者]
严玉霖 高洪 陈玲 陈培富 杨建发 孙文汇 高利波 赵汝
以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)为模板,通过RT-PCR扩增编码非结构蛋白2(Nsp2)的基因,插入到pET32a表达载体中并在大肠埃希氏菌中进行表达。SDS-PAGE电泳结果显示融合表达的Nsp2分子量约为68 kDa,Western blotting分析该融合蛋白能与PRRSV阳性血清发生特异性反应。纯化融合表达产物Nsp2,按100μg/只的剂量与等量弗氏佐剂乳化,经腹腔免疫BALB/c小鼠3次后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,分别以Nsp2和His-Tag为抗原,通过间接EL ISA方法对融合细胞的上清液进行检测,筛选阳性克隆。经过3次亚克隆后,最终得到了6株能稳定分泌...
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